Obtenção de clones de Paracoccidioides brasiliensis e sua relação quanto a produção de gp43 em sobrenadante de cultura

Abstract

Relatamos nossa experiencia tecnica em se obter clones de P. brasiliensis para futuros estudos e os primeiros resultados, utilizando clones de P. brasiliensis, no sentido de estudar a variabilidade de secrecao de gp43 em sobrenadante de cultura. Um dos metodos de obtencao de clones e por meio de micromanipulacao utilizando-se microscopio de micromanipulacao e o segundo metodo e por meio de plaquemento de uma quantidade definida de celulas. Quando o fungo e isolado do paciente, possivelmente a cultura e oriunda de celulas policlonais. Isso talvez implique que a cultura seja constituida por diferentes clones e que , por motivos ainda desconhecidos, ha clones que nao expressam gp43 (molecula imunodominante do sistema) no sobrenadante de cultura. Neste trabalho obtivemos exoantigenos individuais de 30 clones do isolado de P. brasiliensis 113, 30 clones do isolado Pb-18 e 30 clones do isolado Pb339 e pelas tecnicas de SDS-PAGE e imunoblot verificamos a presenca ou nao da gp43. Todos os 30 clones do isolado 113 e do isolado Pb339 secretaram a gp43, mas apresentaram variacao nesta secrecao. 4 entre 30 clones de Pb18 nao produziram gp43 no sobrenadante de cultura. Tres dos 4 clones de Pb18 (Um clone foi inviavel) nao secretores de gp43 foram subcultivados atraves de 10 subrepiques consecutivos e, em seguida, estudados quanto a producao de gp43. A analise destes exoantigenos por SDS-PAGE demonstrou que esses clones voltaram a secretar gp43 e que essa producao nao foi constante e variou com os subrepiques. Todos os clones possuem o gene da gp43, demonstrado por PCR, utilizando primers do gene da gp43. Isso implica que mesmo utilizando cepas clonais de P. brasiliensis, ainda ocorrem problemas quanto a secrecao de gp43, o que leva a pensar em problemas ao nivel de glicosilacao da molecula para sua saida da celula ou problemas quanto a regulacao da sintese dessa glicoproteina