Características clínico-laboratoriais, análise mutacional do gene PIG-A e perfil metabolômico em pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna

Abstract

Introduction: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a disorder due to an acquired abnormality in the phosphatidylinositol glycan class A (PIG-A) gene. This leads to partial or complete absence of all GPI-linked proteins, like the complement regulatory proteins CD59 and CD55, resulting in an increased sensitivity of the red blood cells to the action of complement. The clinical manifestations of PNH include hemolytic anemia, a hypercoagulable state, and reduced hematopoiesis. Aims: 1) To study the clinical characteristics of a group of patients with classical PNH, PNH associated with another bone marrow disorder or subclinical PNH (PNH clone associated with another bone marrow disease); 2) To identify and to correlate PIG-A gene mutations with clinical manifestations in these groups of patients; 3) To compare a metabolomic profile in the hemolytic group with healthy controls, and 4) To compare a metabolomic profile before and after the use of eculizumab. Patients and methods: We studied 109 patients with PNH clone: 56 had hemolytic PNH (44 classical PNH and 12 associated with other bone marrow disorder), and 53 patients had subclinical PNH - PNH clone (defined as at least 0.01% of cells with PNH clone) associated with another bone marrow disease (aplastic anemia in 95% of the cases). The sequencing of the PIG-A gene was performed in 31 patients using the Sanger technique. To perform metabolomic profile, we used mass spectrometry (Kit AbsoluteIDQ p180, Biocrates, Austria) in 23 patients with hemolytic PNH. Besides, in twelve patients samples were also collected before and 24 hours after receiving eculizumab. The statistical analysis was performed by the software MetaboAnalyst 4.0. Results: Among the 109 patients included, 51% were male, the median age at diagnosis was 41 years, ranging from 18 to 81. Among the patients with hemolytic PNH, 86% had fatigue, 66% had hemoglobinuria, 45% abdominal pain and 16% had dysphagia. Venous thromboembolism was observed in 14 cases (25%), with abdominal thrombosis in 7 cases (50%). Seven patients (13%) had arterial thrombosis (stroke or transient ischemic attack). Among the 31 patients analyzed for PIG-A mutations, 29 different variations were detected in 27 patients: 23 were new mutations, with no previous description in the literature, 3 were previously described mutations and 3 were single nucleotide polymorphism. Mutations were predominantly small deletions and simple base changes. There was no correlation between the PIG-A mutations and the clinical manifestations. The major metabolites increased in the PNH group were long- chain acylcarnitines, while the major metabolites reduced in the PNH group were phosphatidylcholines, histidine, glutamate, taurine and aspartate. The C14:1/C16:1 ratio was shown to be a reliable marker in these patients with PNH, suggesting a disorder in lipid elongation. When we evaluated patients immediately before and 24 hours after receiving eculizumab, we noticed a trend toward normalization at C6:1 dosage and C14:1/C6 and C4/C6 ratios. Conclusions: We observed that the clinical characteristics and the distribution of the three subtypes of PNH in this study were similar to other published series, except for relatively lower rates of thrombosis, chronic kidney disease and mortality. PIG-A mutations were detected in the majority of patients with PNH, and almost all (except three) were novel. No correlation was observed between mutation types and clinical manifestation. We found differences in the metabolites of PNH patients when compared to healthy controls, suggesting a different metabolic profile of these patients, returning to normal levels with the use of eculizumab.

Introdução: A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma doença causada por uma anormalidade adquirida no gene da fosfatidilinositol glicano classe A (PIG-A), o que leva à deficiência parcial ou completa das proteínas de ancoragem ligadas ao glicosilfosfatidilinositol (GPI), como as proteínas reguladoras do complemento CD59 e CD55, resultando em um aumento na sensibilidade das hemácias à ação lítica do complemento. As manifestações clínicas incluem um espectro variável de anemia hemolítica, estado pró-trombótico, e hematopoese reduzida. Objetivo: 1) Analisar as características clínico-laboratoriais de 109 pacientes com HPN clássica, HPN associada a outra doença hematológica ou HPN subclínica; 2) Avaliar as mutações do gene PIG-A e possíveis correlações com as manifestações clínicas; 3) Comparar o perfil metabolômico dos pacientes com HPN hemolítica a controles saudáveis; e 4) Comparar o perfil metabolômico antes e após a aplicação de eculizumabe. Pacientes e métodos: Foram estudados 109 pacientes com clone HPN, sendo 56 portadores de HPN hemolítica (44 HPN clássica e 12 HPN associada a outra doença hematológica), e 53 HPN subclínica, definido como pelo menos 0,01% de células com clone HPN associado a outra doença hematológica (anemia aplásica em 95% dos casos). O sequenciamento do gene PIG-A pela técnica de Sanger foi realizado em 31 pacientes. Para avaliação do perfil metabolômico, foi realizado espectrometria de massa (Kit AbsoluteIDQ p180, Biocrates, Áustria) em 23 pacientes com HPN com hemólise significativa, comparados a 166 controles saudáveis. Foi ainda realizada avaliação antes e 24 horas após a dose de eculizumabe em 12 pacientes. A análise estatística foi feita através do software MetaboAnalyst 4.0. Resultados: Dos 109 pacientes incluídos, 51% eram do sexo masculino. A mediana de idade ao diagnóstico foi de 41 anos, variando de 18 a 81 anos. Dentre os pacientes com HPN hemolítica, 86% apresentavam fadiga, 66% hemoglobinúria, 45% dor abdominal e 16% disfagia. Tromboembolismo venoso foi observado em 14 casos (25%), sendo trombose abdominal em 7 casos (50%). Sete pacientes (13%) apresentaram trombose arterial (acidente vascular cerebral e acidente isquêmico transitório). Nos 31 pacientes analisados quanto a mutações do PIG-A, foram detectadas 29 variantes diferentes em 27 pacientes. Entre elas, 23 eram novas mutações, sem descrição prévia na literatura, 3 eram mutações já publicadas e 3 eram polimorfismos de nucleotídeo único. As mutações foram predominantemente de pequenas deleções e simples troca de bases. Não houve qualquer correlação entre as mutações encontradas e as manifestações clínicas dos pacientes. Os principais metabólitos aumentados nos pacientes com HPN foram acilcarnitinas de cadeia longa, enquanto os principais metabólitos reduzidos nos pacientes com HPN foram fosfatidilcolinas, histidina, glutamato, taurina e aspartato. A razão de C14:1/C16:1 mostrou-se um marcador confiável de HPN, sugerindo que há elongação dos lipídeos nesses pacientes, o que não acontece nos controles. Quando avaliamos pacientes imediatamente antes de receber eculizumabe e 24 horas após a administração do medicamento, notamos uma tendência a normalização na dosagem de C6:1 e nas razões C14:1/C6 e C4/C6, correspondentes a atividade de desidrogenases de acil-CoA de cadeia média e curta, respectivamente. Conclusão: Observamos que as características clínicas e a distribuição entre os três subtipos de HPN nesse grupo de portadores de HPN foram semelhantes às de outras séries da literatura, exceto por menores taxas de trombose, doença renal crônica e mortalidade. Foram detectadas mutações no PIG-A na maioria dos pacientes com HPN, sendo quase todas (exceto três) ainda não previamente descritas, não sendo observada correlação entre os tipos de mutação e a manifestação clínica. Encontramos diferenças nos metabólitos dos pacientes com HPN quando comparados aos controles saudáveis, sugerindo um perfil metabolômico próprio destes pacientes, além da tendência a normalização desses metabólitos após o uso de eculizumabe.