doctoralThesis
Avaliações bioenergéticas mitocondriais em tecidos permeabilizados do zebrafish (Danio rerio)
Autor
AZEVEDO, Rafael David Souto de
Institución
Resumen
Após a identificação de que a mitocôndria participa ativamente de vários processos que regulam a função e a sobrevivência celular esta organela passou a ser utilizada como janela experimental para diversas áreas do conhecimento como Fisiologia e Ecotoxicologia, por exemplo. Neste trabalho o modelo experimental zebrafish (Danio rerio) foi utilizado para estudo da bioenergética mitocondrial através de tecidos seletivamente permeabilizados.Neste sentido, foi demonstrado como a mitocôndria do zebrafish é uma ferramenta útil para estudos na área de toxicologia (ambiental e farmacológica), bioquímica de proteínas, respiração mitocondrial, homeostase de cálcio e geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROS e ERNS). Além disso, a tecido-especificidade mitocondrial entre fígado, cérebro, músculo cardíaco e músculo esquelético e os possíveis efeitos deletérios do pesticida piriproxifeno foram estudadas. Para isso, os tecidos foram permeabilizados com digitonina ou saponina eestudadoso funcionamento dos complexos respiratórios da cadeia transportadora de elétrons, a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (utilizando H₂DCF-DA, MitoSOX e DAF-FM-DA) e captação de cálcio(com Calcium Green 5N).Como resultados observou-se que a mitocôndria do zebrafish é uma ferramenta altamente atrativa mitocondriólogos de todo mundo. Coração e músculo esquelético mostraram diferenças para o consumo de O₂ pelo complexo I quando comparados com fígado e cérebro.O músculo esquelético teve o maior consumo de oxigênio para os complexos II e IV (51% e 65% maiores, respectivamente). A geração de espécies reativas (ERs) com H₂DCF-DA mostrou que fígado e coração possuem maior susceptibilidade para geração de EROS, cerca de 58% maior que o gerado por cérebro e musculo esquelético. Além disso, a geração de EROS foi Ca²⁺ dependente para todos os tecidos estudados.Cérebro, seguido pelo fígado, foi o tecido permeabilizado com maior potencial para geração de O₂•ˉ (96% e 68% maior que músculo cardíaco e esquelético, respectivamente). Por fim, uma exposição a pequenas doses do pesticida piriproxifeno foi capaz de afetar o controle respiratório (CR) dos complexos I e II em tecidos cerebrais.Houve um aumento na geração de ERs e este teve um efeito dose dependente para geração de O₂•ˉ. Em síntese, o zebrafish é uma ferramenta de baixo custo altamente atrativa para estudo da bioenergética mitocondrial e tem permitido a avaliação de propriedades tóxicas de diversos compostos, inclusive para os que possuem escopo terapêutico. CNPq Behind mitochondrial activity be linkage with cell survive and function, this organelle has been widely used as an experimental window to many scientific areas such as physiology and ecotoxicology. In this work the zebrafish (Danio rerio) experimental model was used to mitochondrial bioenergetic study through of selective permeabilized tissues. In this hand, was showed the zebrafish mitochondria such as useful tool to studies about toxicology (environmental and pharmacological), protein biochemistry, mitochondrial respiration, calcium homeostasis and reactive oxygen e nitrogen species (ROS and RNS) generation. In another hand, the mitochondrial tissue-specificity between hepatic, neuronal, muscular cardiac and muscular skeletal (SM) tissues, beyond possible pyriproxyfen side effects was studied using mitochondrial bioenergetic as physiological state translator. For this, mitochondrial respiratory complexes, ROS and RNS (using H₂DCF-DA, MitoSOX e DAFFM- DA) and Ca²⁺ uptake (by Calcium Green 5N) was studied through of tissue selective permeabilization with digitonin or saponin. As result, zebrafish mitochondrial study is a very attractive tool due a lot of benefits that this little teleost fish introduces to mitochondriologists community around the world. Heart and SM showed differences to O₂ consume at NADH dehydrogenase level when compared with liver and brain. SM have higher O₂ consume for Succinate dehydrogenase and Cytochrome c oxidase (51 and 65% higher, respectively).Reactive species (RS) generation by H₂DCF-DA showed that liver and heart have more susceptibility to RS generation (around 58% more that brain or SM). Furthermore, RS generation was Ca²⁺-dependent for all studied tissues. Brain, followed by liver, was permeabilized tissue with high potential to O₂•ˉ generation. (96% and 68% more that heart and SM, respectively).Ca²⁺ transport showed that brain tissue has high affinity to Ca²⁺ uptake. Lastly, pyriproxyfen lower concentrations affected the respiratory control (RC) to neuronal NADH dehydrogenase and Succinate dehydrogenase of respiratory chain. Pyriproxyfen side effects maximize RS generation and showed a dose-dependent effect to O₂•ˉ generation.As well as for nitric oxide production and calcium transport.In summary, zebrafish is a highly attractive low-cost tool for mitochondrial bioenergetics study and has viabletoxic propertiesevaluation of several compounds, including as therapeutic scope.