masterThesis
Purificação, caracterização e avaliação de atividade imunomoduladora de lectina de inflorescência de Alpinia purpurata
Registro en:
BRITO, Jéssica de Santana. Purificação, caracterização e avaliação de atividade imunomoduladora de lectina de inflorescência de Alpinia purpurata. 2018. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Fisiologia) – Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2018.
Autor
BRITO, Jéssica de Santana
Institución
Resumen
Alpinia purpurata é uma planta ornamental também conhecida como fonte de moléculas bioativas. Lectinas são proteínas capazes de se ligar a carboidratos e exercerem diversas atividades biológicas. O presente estudo descreve o isolamento de uma lectina extraída das inflorescências de A. purpurata (ApuL) e a avaliação de seu potencial imunomodulador. Proteínas foram extraídas da farinha das brácteas através de homogeneização (16 h, 4ºC) em NaCl 0,15 M. Após filtração e centrifugação, o extrato obtido foi tratado com sulfato de amônio (40% de saturação) durante 4 h a 28ºC. As frações de proteínas precipitadas (FP) e sobrenadante (FS) foram dialisadas e avaliadas quanto à concentração de proteínas e atividade hemaglutinante (AH). A fração com maior AH específica (FS) foi submetida à cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-75. Frações de 5 mL foram coletadas e avaliadas quanto a absorbância a 280 nm e AH. O primeiro pico obtido nessa cromatografia correspondeu à lectina, que foi caracterizada quanto à massa molecular nativa, composição em subunidades, especificidade de ligação a carboidratos e estabilidade da AH frente a variações de temperatura e pH. A ação imunomoduladora foi avaliada investigando a produção de citocinas e liberação de óxido nítrico por células mononucleares de sangue periférico humano incubadas ou não com a lectina (12,5 μg/mL). Além disso, a diferenciação e ativação de linfócitos foram avaliadas por ensaios de imunofenotipagem. ApuL é uma proteína acídica, com massa molecular nativa de 34 kDa, e oligomérica (formada por subunidades de 7,4 kDa). AH da lectina foi inibida pelas glicoproteínas fetuína e ovoalbumina; resistente ao aquecimento a 100 °C por 20 min; estimulada na presença de íons cálcio e magnésio; e maior em pH 7,5. ApuL induziu as células de sangue periférico a liberarem citocinas pertencentes aos perfis Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-6) e Th17 (IL- 17A), bem como óxido nítrico, estimulando um ambiente pró-inflamatório. Além disso, ApuL estimulou a produção de IL-10, uma citocina anti-inflamatória com papel regulador. A incubação com a lectina promoveu diferenciação e ativação dos subconjuntos de linfócitos T CD8+ e CD4+, como evidenciado pela maior expressão da molécula CD28. Em conclusão, a inflorescência de A. purpurata é fonte de uma lectina com ação imunomoduladora e potencial aplicação biomédica, o que adiciona valor biotecnológico a esta planta ornamental. CAPES Alpinia purpurata is an ornamental crop also known as source of bioactive molecules. Lectins are proteins capable of binding carbohydrates and that exert several biological properties. The present study describes the isolation of a lectin extracted from the bracts of inflorescences of A. purpurata (ApuL) and the evaluation of its immunomodulatory potential. Proteins were extracted from the bracts flour by homogenization (16 h, 4 °C) in 0.15 M NaCl. After filtration and centrifugation, the extract obtained was treated with ammonium sulfate (40% saturation) for 4 h at 28 °C. The precipitated (PF) and supernatant (SF) fractions were dialyzed and evaluated for protein concentration and hemagglutinating activity (HA). SF, which was the fraction with highest specific HA, was submitted to gel filtration chromatography on a Sephadex G-75 column. Fractions of 5 mL were collected and evaluated for absorbance at 280 nm and HA. The first peak obtained in this chromatography corresponded to the lectin, which was characterized for native molecular mass, subunit composition, carbohydrate-binding specificity, and stability of HA toward temperature and pH variation. The immunomodulatory action was evaluated by investigating cytokine production and release of nitric oxide by human peripheral blood mononuclear cells treated or not with the lectin (12.5 μg/mL). In addition, the differentiation and activation of lymphocytes were evaluated by immunophenotyping assays. ApuL is an acidic, 34-kDa native molecular mass, and oligomeric protein (formed by subunits of 7.4 kDa). HA of lectin was inhibited by the glycoproteins fetuin and ovalbumin; resistant to heating at 100 °C for 20 min; stimulated in the presence of calcium and magnesium ions; and highest at pH 7.5. ApuL induced peripheral blood cells to release cytokines belonging to the Th1 (IFN-γ, TNF-α, and IL-6) and Th17 (IL-17A) profiles, as well as nitric oxide, stimulating a pro- inflammatory environment. In addition, ApuL stimulated the production of IL-10, an anti-inflammatory cytokine with regulatory role. Incubation with the lectin promoted differentiation and activation of the CD8+ and CD4+ T lymphocyte subsets, as evidenced by the greater expression of the CD28 molecule. In conclusion, the inflorescence of A. purpurata is source of a lectin with immunomodulatory action and potential biomedical application, which adds biotechnological value to this ornamental plant.