Padronização da coaglutinação na preparação de ácidos nucléicos do parvovírus canino e vírus da cinomose para diagnóstico molecular

Abstract

A cinomose e a parvovirose canina são duas enfermidades infecto-contagiosas de grande importância para a clínica de pequenos animais onde a PCR vem sendo aplicada com ótimos resultados no diagnóstico. No entanto, para o sucesso da técnica, é necessário que o ácido nucléico esteja o mais puro possível e livre de inibidores das polimerases (Transcriptase reversa e/ou Taq DNA polimerase), desejando-se um método de extração simples e rápido. O teste de coaglutinação utilizando o Staphylococcus aureus (COA) é baseado na propriedade da proteína A de se ligar especificamente à porção Fc da imunoglobulina G de alguns mamíferos e algumas subclasses de IgG de camundongos. Assim, neste trabalho utilizou-se a coglutinação para obtenção de DNA ou RNA livres de inibidores, com capacidade de concentração de partículas virais dispersas nas amostras biológicas e de forma simples, rápida e de baixo custo. Para tanto, 10 amostras de fezes positivas para o vírus da parvovirose canina e 17 amostras de urina positivas para o vírus da cinomose foram submetidas à extração de ácidos nucléicos utilizando o COA e kits comerciais para posteriormente serem analisadas pela PCR em tempo real e PCR convencional respectivamente. As amostras de fezes foram diluídas de 1: 10 a 1: 100 000 e as amostras de urina foram utilizadas puras. A metodologia desenvolvida foi eficiente na extração dos dois tipos de amostra. O método proposto demonstrou ser confiável e de baixo custo para a preparação de DNA e RNA viral para o diagnóstico molecular.

PCR presents excellent results for the diagnosis of canine distemper and canine parvoviruses, two important infectious and contagious diseases for small animal internal medicine. However, success of technique depends on nucleic acid samples free of polymerase inhibitors (Reverse Transcriptase and / or Taq DNA polymerase). The coagglutination test using Staphylococcus aureus (COA) is based on the property of specific binding of protein A to the Fc portion of immunoglobulin G of some mammals and some of IgG subclasses of mice. This work was carried out the coagglutination procedure to obtain nucleic acid inhibitors free, with capacity for viral particle concentration dispersed in biological samples, simply, quickly and low cost. For this purpose, 10 canine parvovirus positive stool samples and 17 canine distemper virus positive urine samples were submitted to the preparation of nucleic acids using the COA and commercial kits in order to be analyzed by real-time PCR or conventional PCR respectively. Fecal specimens were diluted from 1: 10 to 1: 100 000 and urine samples were used pure. The developed methodology was efficient in extracting the two types of sample. The method proposed demonstrated to be reliable and cheap to prepare viral DNA or RNA for molecular diagnosis.