Tesis
Revelando o potencial de Clonostachys byssicola em produzir enzimas holocelulolíticas
Fecha
2018-02-15Registro en:
GOMES, Helder Andrey Rocha. Revelando o potencial de Clonostachys byssicola em produzir enzimas holocelulolíticas. 2017. 214 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.
Autor
Gomes, Helder Andrey Rocha
Institución
Resumen
Os fungos filamentosos saprofíticos representam fontes promissoras de enzimas holocelulolíticas, e o cultivo desses organismos em fontes de carbono indutoras baratas, como resíduos agrícolas, permitiria a obtenção de coquetéis enzimáticos com custos reduzidos. Neste trabalho, o potencial de um isolado de Clonostachys byssicola para a produção de enzimas holocelulolíticas é descrito. A avaliação do secretoma produzido pelo fungo em cultivo submerso com diversas fontes de carbono lignicelulósicas através de eletroforese em BN-PAGE revelou a presença de bandas de alta massa molecular, correspondentes à complexos proteicos putativos. A partir da identificação desses complexos por LC-MS/MS, verificou-se que os complexos abrigam diversas enzimas envolvidas na degradação de holocelulose, como celulases, mananases, xilanases e pectinases. Os complexos também são cataliticamente ativos, uma vez que foi possível identificar atividade enzimática in gel. Em outra etapa do trabalho, o secretoma do fungo obtido em fontes de carbono comerciais (Avicel, carboximetilcelulose-CMC e xilana de aveia) e agroindustriais (sabugo de milho, casca do grão de soja, engaço de bananeira e bagaço de cana-de-açúcar) foi caracterizado por LC-MS/MS. A maior diversidade de proteínas foi identificada no secretoma obtido em Avicel, seguido pelo secretoma obtido em sabugo de milho. Foram identificadas várias enzimas relacionadas à degradação da lignocelulose, o que evidencia que o fungo é capaz de produzir sistemas enzimáticos completos específicos para cada uma das principais frações da holocelulose: celulose, hemiceluloses e pectina. Os secretomas obtidos em resíduos agroindustriais foram empregados para sacarificar sabugo de milho e bagaço de cana-de-açúcar parcialmente delignificados. Os extratos brutos produziram mais açúcares a partir da hidrólise do sabugo, revelando uma maior digestibilidade deste substrato quando comparado ao bagaço, o que pode decorrer do menor teor de lignina observado após o tratamento do sabugo de milho. Os secretomas permitiram a solubilização de grande parte da xilana presente no sabugo de milho, com a liberação de xilobiose como principal produto de hidrólise. O isolado de C. byssicola foi ainda avaliado quanto à capacidade de produção de enzimas pectinolíticas quando cultivado em meio contendo casca de laranja como única fonte de carbono. O fungo foi capaz de secretar pectinases e pectato liases. A caracterização do secretoma feita por LCMS/MS revelou uma grande diversidade de enzimas atuantes na cadeia principal e sobre substituintes laterais. Uma fração parcialmente purificada foi caracterizada quanto ao efeito da temperatura e pH, e a atividade de pectinase foi máxima a 50ºC, e na faixa de pH entre 4,5 e 6,0. Estas características sugerem a aplicação da enzima para o tratamento de sucos de frutas com baixa acidez. Uma das enzimas parcialmente purificada foi identificada por LC-MS/MS, e a partir desta identificação, o transcrito correspondente foi clonado com sucesso em Escherichia coli, e a etapa de expressão em Pichia pastoris se encontra em andamento. Todos os resultados deste trabalho revelam C. byssicola como uma nova fonte de enzimas holocelulolíticas, que ainda precisa ser explorada.