Tesis
Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C
Fecha
2021-05-23Registro en:
SANTOS, José Carlos dos. Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C. 2011. vii, 63 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2011.
Autor
Santos, José Carlos dos
Institución
Resumen
O vírus da hepatite C (HCV) é um importante patógeno humano afetando 3% da
população humana. A infecção crônica é frequente sendo uma das principais causas de
cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Estudos de soroprevalência indicam que pelo
menos 200 milhões de pessoas tenham sido infectadas no mundo sendo que somente no
Brasil aproximadamente 2 milhões de casos foram relatados até 2003. Vários kits de
diagnóstico baseados EIA (Enzyme immunoassay) estão disponíveis no mercado para a
detecção de anticorpos anti-HCV no plasma. No entanto, devido à distribuição geográfica
distinta de todos os genótipos do HCV no mundo, estes kits nem sempre apresentam um
bom desempenho nas diferentes localidades do mundo. Atualmente, esses kits utilizam
antígenos peptídicos (kits de terceira geração) ou antígenos recombinantes (kits de quarta
geração) de ambas as regiões, estruturais e não estruturais, da proteína viral. A exigência
de múltiplos peptídeos e/ou múltiplas proteínas recombinantes para o diagnóstico confiável
de infecção pelo HCV aumenta o custo destes kits. A fim de reduzir o custo de fabricação e
aumentar a especificidade dos kits de detecção de HCV desenvolvemos uma cadeia única
de proteína multiepitopo recombinante composta de várias partes das regiões estruturais e
não estruturais da proteína viral. Este gene sintético, com 948 pb, e que codifica para uma
proteína multiepitopo HCV (denominado r-MEHCV) foi clonado no vetor pET21a.
Células de Escherichia coli BL21 (λDE3) foram transformadas com o plasmídeo resultante
e a expressão induzida com 1 mM IPTG. Após 8 h de indução, uma proteína com massa
molecular aparente de ~37 kDa foi observada. A proteína recombinante foi purificada até
homogeneidade por meio de uma única etapa por cromatografia de afinidade com resina
Ni-NTA. A expressão bem-sucedida, assim como os ensaios realizados com a construção
de um ELISA “caseiro” baseado na r-MEHCV, no quais amostras de soros reagentes e não
reagentes para HCV e reagentes para outras patologias foram analisadas, mostraram que
esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de um autêntico kit brasileiro para
fins de diagnóstico da hepatite C. Análises de dicroísmo circular em pH 7 e 8 mostraram
que essa proteína apresenta um padrão de dobramento compatível com estruturas
secundária e terciária.