Efecto del Péptido Antimicrobiano Ib-M1 Sobre la Membrana de Escherichia coli O157:H7

Abstract

Escherichia coli O157:H7 es el serotipo más frecuente en casos de disentería de población menor de cinco años. Antibióticos como la azitromicina, fosfomicina y meropenem se han utilizado en la fase inicial de la enfermedad tratando prevenir el Síndrome Hemolítico Urémico (SHU); sin embargo, el aumento de la resistencia de E. coli a los antibióticos ha conducido a la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas. El péptido Ib-M1 ha mostrado actividad bactericida contra E. coli O157:H7 y baja toxicidad en células de mamíferos; no obstante, sus mecanismos de acción aún son desconocidos. Ib-M1 es una molécula catiónica y anfifílica; esto sugiere que su efecto antimicrobiano podría estar asociado a una interacción con la membrana bacteriana. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar el efecto de Ib-M1 sobre la permeabilización de membrana de E coli O157:H7 Se determinaron las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) de Ib-M1 en cepas de E. coli O157:H7 mediante microdilución; polimixina y estreptomicina fueron usados como antibióticos de referencia. La permeabilidad de membrana externa se determinó empleando N-fenyl-1-naftilamina (NPN) en E. coli O157:H7 utilizando concentraciones desde CMIx1 hasta CMIx32, las mediciones fueron realizadas por espectrofluorometría durante 30 minutos. La permeabilidad de la membrana interna fue realizada por hidrólisis de O-nitrofenil-β-galactosidasa (ONPG) en E. coli ML35 evaluando concentraciones desde CMIx1 hasta CMIx32, las lecturas espectrofotométricas fueron realizadas durante 6 horas. Las alteraciones morfoestructurales fueron analizadas mediante Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) en la cepa E. coli O157:H7 tratada con Ib-M1 a los 30, 60 y 120 minutos de exposición. Ib-M1 causó permeabilización de la membrana externa de E. coli O157:H7 a partir de la CMIx1. La membrana interna de E. coli ML35 fue permeabilizada por Ib-M1 a concentraciones de CMIx1 y CMIx2. En MEB mostraron bacterias colapsadas con rugosidad pronunciada en el grupo de E coli O157:H7 tratada con Ib-M1. Los cambios observados mediante MEB, como la perdida de la densidad celular, indican que su mecanismo no está asociado a tipo lítico.

Escherichia coli O157:H7 is the most common serotype in cases of dysentery in the population under five years of age. Antibiotics such as azithromycin, fosfomycin and meropenem have been used in the initial phase of the disease trying to prevent Hemolytic Uremic Syndrome (HUS); however, the increasing resistance of E. coli to antibiotics has led to the search for new therapeutic alternatives. The Ib-M1 peptide has shown bactericidal activity against E. coli O157:H7 and low toxicity in mammalian cells; however, its mechanisms of action are still unknown. Ib-M1 is a cationic and amphiphilic molecule; this suggests that its antimicrobial effect could be associated with an interaction with the bacterial membrane. The present work aims to evaluate the effect of Ib-M1 on the membrane permeabilization of E coli O157:H7. The Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) of Ib-M1 in strains of E. coli O157:H7 were determined by microdilution; polymyxin and streptomycin were used as reference antibiotics. The outer membrane permeability was determined using N-phenyl-1-naphthylamine (NPN) in E. coli O157:H7 using concentrations from CMIx1 to CMIx32, measurements were made by spectrofluorometry for 30 minutes. The permeability of the inner membrane was performed by hydrolysis of O-nitrophenyl-β-galactosidase (ONPG) in E. coli ML35, evaluating concentrations from CMIx1 to CMIx32, spectrophotometric readings were performed for 6 hours. The morphostructural alterations were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM) in the strain E. coli O157:H7 treated with Ib-M1 at 30, 60 and 120 minutes of exposure. Ib-M1 caused permeabilization of the outer membrane of E. coli O157:H7 from CMIx1. The inner membrane of E. coli ML35 was permeabilized by Ib-M1 at concentrations of CMIx1 and CMIx2. In SEM they showed collapsed bacteria with pronounced roughness in the group of E coli O157: H7 treated with Ib-M1. The changes observed by SEM, such as the loss of cell density, indicate that its mechanism is not associated with a lytic type.