ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE ADN Y VALIDACIÓN DE LA PCR MÚLTIPLE PARA DETECTAR Listeria monocytogenes EN QUESO, LECHE, CARNE DE RES Y POLLO

Abstract

Este trabajo validó la técnica de PCR para la detección de L. monocytogenes a partir de ADN de cultivos puros y en muestras de leches crudas, quesos frescos, carne de res y carne de pollo. En DNA de cultivos puros la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad encontrada fue de 100%, 101UFC/ml y K=1, respectivamente. Para la extracción del ADN de los alimentos se emplearon dos métodos, el primero, basado en la precipitación alcohólica en presencia de NaI, lo que redujo en gran medida las grasas; permitiendo la detección directa de 101 UFC/ml en leche cruda y 105 UFC/g en queso fresco. El segundo método, basado en la extracción con lisozima, proteinasa K y fenol-cloroformo, permitió establecer límites de detección de 102 y 104 UFC/g para las carnes de res y pollo respectivamente. La PCR se basó en la especificidad de los iniciadores LI1/U1 que amplificaron una banda de 938 pb (identificación de género) característica del rDNA 16S y los iniciadores LF/LR que amplificaron una banda de 750 pb característica del gen hlyA (identificación de especie). Los resultados de la validación reportaron con relación al método “Gold Standard” una reproducibilidad, sensibilidad y especificidad del 100% en leches crudas. Para las muestras de queso frescos se reportó una reproducibilidad de 97%, sensibilidad 96.3% y especificidad del 100%, para la carne de pollo la reproducibilidad fue 98.43%, sensibilidad 96.9%, especificidad 100%, valor predictivo positivo 100% y valor predictivo negativo 100%, para la carne de res todos los parámetros fueron 100%. El método “Gold Standard” reportó 100% para todos los parámetros. El trabajo muestra que ambas técnicas pueden ser utilizadas para detectar L. monocytogenes en este tipo de alimentos y que la PCR reduce el tiempo de ensayo considerablemente.