Validação de monocamadas peptídicas auto-organizadas com marcador redox no desenvolvimento de imunossensores capacitivos

Abstract

A detecção de doenças demanda a busca por dispositivos de baixo custo, com respostas rápidas, sensíveis e seletivas, e que possam ser usados fora de laboratórios especializados (point-of-care). Isso é possível por meio do uso de imunossensores eletroquímicos eficazes no reconhecimento de biomoléculas (biomarcador) de relevância clínica. A eficiência dos imunossensores está associada a formação de monocamadas estáveis e inertes aos demais componentes do sistema. Filmes de peptídeos nanoestruturados contendo uma molécula redox ativa são úteis para o desenvolvimento de imunossensores, por serem estáveis e com propriedades físico-químicas controláveis. Neste trabalho, sequências peptídicas contendo uma molécula de ferroceno foram avaliadas na formação de monocamadas auto-organizadas. A melhor matriz peptídica obtida foi a de sequência Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2, com um rendimento global de síntese de 12%. Esse pequeno rendimento é atribuído principalmente a baixa estabilidade do ferroceno ao meio ácido utilizado na síntese. Sequências contendo um resíduo de Ala a mais ou a menos foram também avaliadas, mas com resultados inferiores em relação aos imunossensores obtidos. Sobre esses filmes peptídicos foram depositados anticorpos ou aptâmeros de DNA para a detecção da proteína CRP, que é um biomarcador de processos inflamatórios e doenças cardíacas. A espectroscopia de impedância eletroquímica e sua derivada capacitância foram utilizadas como técnicas, obtendo-se imunossensores com limites de detecção melhores que os já descritos na literatura, isto é, de 240 pM utilizando-se o anticorpo, e 7,2 pM para o aptâmero. O melhor resultado obtido para o aptâmero, pode ser explicado pelo seu menor tamanho em relação ao anticorpo, o que permite uma maior alteração eletrônica quando ocorre a ligação da CRP, resultando em uma sensibilidade do sistema quase 8 vezes maior (87,7 %) em relação ao imunossensor constituído pelo anticorpo (11,4 %). Ensaios de PM-IRRAS permitiram relacionar os dados analíticos obtidos com a organização do sistema, sendo que quanto maior a estruturação, melhor a detecção. A aplicação do modelo de Langmuir-Freundlich corroborou com os resultados, demonstrando que a monocamada peptídica de sequência Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2 apresentou um processo de formação de SAM homogênea, com índice de heterogeneidade próximo a 1. Os resultados obtidos permitem afirmar que as monocamadas peptídicas auto-organizadas podem ser utilizadas para o desenvolvimento de biossensores com diferentes sistemas antígeno/anticorpo, o que permitiria a montagem de novos sistemas “point-of-care ”.

Detection of diseases requires devices that can be inexpensive, with fast, sensitive and selective responses, and can be used outside specialized laboratories (point-of-care). This is possible with electrochemical immunosensors made of nanostructured films, which effective immobilization of biomolecules is obtained to recognize biomolecules (biomarkers) of clinical relevance. Nanostructured peptide films containing an active redox molecule are useful for immunosensors because they are stable and have controllable physicochemical properties. In this work, synthesis of peptides containing redox molecules of ferrocene as self-assembled monolayers (SAMs) were studied. The best peptide matrix comprised the sequence Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2, with a global synthesis yield of 12%. This small yield is attributed by the low stability of the ferrocene in acid medium of the synthesis. Sequences containing a plus or minus Ala residue were also evaluated, showing poorest results than the immunosensors obtained. A layer of antibodies and/or aptamers of CRP, an inflammatory processes and cardiac disease biomarker, was deposited on these peptide films, developing an electrochemical immunosensor for the detection and quantification of CRP. Techniques such electrochemical impedance spectroscopy and its capacitance derived were performed, achieving immunosensors with limit of detection better than those already studied, 240 pM using the antibody as bioreceptor, and 7,2 pM, for the aptamer. The enhanced performance using the aptamer demonstrated better efficiency, once its smallest size allows a better change in the electronic system when occurs the CRP bonding, resulting in a sensitivity of the system almost 8 times superior (87.7%) than the immunosensor constituted by the antibody (11.4%). The PM-IRRAS assays in agreement with the data obtained demonstrated that organization of the system is crucial for an improved detection. The application of the Langmuir-Freundlich model also corroborated with the results, demonstrating that the peptide monolayer sequence Fc-Glu-Ala-Ala-Cys-NH2 presented a homogeneous SAM formation process with a heterogeneity index close to 1. The results obtained enable to confirm that peptides monolayers can be used for the development of biosensors with different antigen/antibody systems, which would permit the advance of new point-of-care systems.