Utilização de PCR em tempo real quantitativo para diagnóstico diferencial entre Salmonella enterica subesp. enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Gallinarum (biovares Gallinarum e Pullorum) em aves domésticas (Gallus gallus)

Abstract

Produtos avícolas são frequentemente associados a surtos alimentares ocasionados por Salmonella spp. e atualmente, existem 2659 sorovares de Salmonella. Os programas existentes para prevenção e controle da infecção por essa bactéria, são complexos devido às várias fontes de contaminação presentes na indústria avícola. A obtenção de um teste diagnóstico rápido para a identificação de bactérias é crucial, para implementar rapidamente as medidas de controle, a fim de conter a propagação bacteriana, reduzir as perdas na produção animal e evitar riscos de infecções transmitidas por alimentos à saúde humana. O objetivo do presente estudo foi realizar a padronização e aplicação da técnica da PCR em tempo real para identificação e quantificação da carga bacteriana em órgãos e fezes de aves comerciais infectadas por Salmonella enterica subesp. enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Gallinarum (biovares Gallinarum e Pullorum), em diferentes momentos pós-infecção. O presente estudo realizou a padronização de duas reações multiplex qPCR utilizando SYBr Green, uma reação para quantificação e diagnóstico diferencial entre S. Gallinarum e S. Pullorum, e outra para quantificar e diferenciar S. Enteritidis e S. Typhimurium . Após a padronização da qPCR, quatro grupos experimentais foram inoculados com cada estirpe estudada, por via oral, na 13ª semana de vida das aves. Aos quatro e sete dias após o desafio, três aves de cada grupo foram submetidas à eutanásia, para obtenção de amostras de fígado e conteúdo cecal. Após a colheita das amostras, foram realizadas identificação e quantificação bacteriana pela PCR em tempo real e pela microbiologia convencional. De acordo com a padronização das reações multiplex qPCR, as temperaturas de Melting (Tm) foram avaliadas para obtenção do diagnóstico diferencial. Para a primeira reação, o iniciador pSGP (97pb) obteve Tm de 78°C, para ambos biovars. O iniciador pSG (273pb) obteve 86,2°C de Tm para identificação de S. Gallinarum e o iniciador pSP (260pb) com Tm de 84,8°C para S. Pullorum. Para a segunda reação, observou-se uma Tm de 85°C (206pb) para S. Enteritidis e uma Tm de 79°C (62pb) para S. Typhimurium. Com a obtenção da curva padrão, foi possível evidenciar a alta sensibilidade do teste proposto, uma vez que possibilitou a obtenção de oito pontos de quantificação, iniciando em 108 UFC/mL e finalizando em 101 UFC/mL. Quando as reações foram aplicadas em amostras provenientes de aves infectadas com as respectivas bactérias, foi possível comprovar a alta sensibilidade e especificidade de qPCR, especialmente quando as amostras foram provenientes de fezes, pois permitiu a obtenção de resultados positivos mesmo em amostras com grande quantidade de contaminantes e baixa carga bacteriana. Em decorrência do presente estudo, reações multiplex qPCR com alta sensibilidade, especificidade e com base na fluorescência de SYBr Green foram padronizadas. Além disso, esta metodologia alia baixo custo ao resultado diagnóstico rápido, tornando esse método atraente para aplicação em análises de rotina laboratorial.

Poultry p roducts are often associated with food outbreaks from Salmonella spp. and c urrently there are 2659 Salmonella serovars. Existing programs for disease prevention and control are complex due to the various sources of contamination within the poultry industry . Obtaining a rapid diagnostic test for identification of bacteria is cruci al in order to rapidly implement control measures to contain bacterial spread, to reduce losses in animal production and to avoid risks from food - borne infections to human health. The objective of the present study was to perform a standardization and application of the real - time PCR for indirect diagnosis and quantification of bacterial load in organs and feces of commercial birds infected by Salmonella enterica subesp. enterica so rovares Enteritidis, Typhimurium and Gallinarum (biovares Gallinarum and Pullorum), a t different post - infection moments. The present work describes the development of two multiplex qPCR using a low - cost DNA dye (SYBr Green) , one for quantification and diff erential diagnosis between S . Gallinarum and S . Pullorum , and another to quantify and differentiate S . Enteritidis and S . Typhimurium . After qPCR standardization , f our experimental groups were inoculated with each strains , orally at the 13th week of life of the birds. At four and seven days post challenge, t h ree birds from each group were euthanasia for liver and cecal content sample s collection. After the sampling , was carried out b acterial identification and quantification by real - time PCR and conventional microbiology . According to the multiplex qPCR standardization, the melting temperatures ( Tm ) was evaluated to obtain the differential diagnosis . For the first reaction, t he pSGP amplicon (97 bp) showed Tm of 78°C for both biovars. The pSG amplicon (273 bp) showed a Tm of 86.2°C for S . Gallinarum and pSP amplicon (260 bp) dissociated at 84.8°C for S . Pullorum identification. For the second reaction, a Tm of 85°C ( 206bp ) amplified product for S . Enteritidis and Tm of 79°C ( 62bp ) amplified product for S . Typhimurium . The standard curve showed the high sensitivity of the proposed test, since it was possible to obtain eight quantification points, vii starting at 10 8 CFU/mL and ending at 10 1 CFU/mL. When the reaction s were applied in samples from birds infected with each respective bacteria, it was possible to evidence the high sens itivity and specificity of qPCR , especially when the samples came from feces, because obtained positive results even from samples with a large number of contaminants and low bacterial load. As a result of the present study, multiplex qPCR reaction s with high sensitivity, specificity and based on the fluorescence of SYBr Green was standardi zed. In addition, this methodology aligns low cost to the faster diagnostic result, making it attractive for application in routine laboratory analyzes.