Tesis
Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL)
Fecha
2010Registro en:
RIBEIRO, João Augusto. Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL). 2010. 1 CD-ROM. Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biomédicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu, 2010.
000695085
ribeiro_ja_tcc_botib.pdf
7449821021440644
Autor
Cano, Maria Isabel Nogueira [UNESP]
Silveira, Rita de Cássia Viveiros da [UNESP]
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Institución
Resumen
As proteínas da família TRF2 (“TTAGGG repeat-binding factor 2”) fazem parte de complexos multiprotéicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita. São eles, o domínio de interação com o DNA do tipo Myb-like, localizado na porção C-terminal, um domínio acídico N-terminal e um domínio de homodimerização TRFH (“TRF homology domain for homodimerization”). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas “t-loops”. O intuito deste projeto é a clonagem, expressão em vetor bacteriano (pMAL) e a purificação de uma proteína homóloga as proteínas teloméricas TRFs humana em parasitas do gênero Leishmania, especificamente a espécie Leishmania amazonensis (LaTRF). Primeiramente foram desenhados iniciadores (primers) utilizados para a amplificação da sequência LaTRF por PCR. O(s) produto(s) de amplificação foram clonados em vetores de clonagem para produtos de PCR e sequenciados para análise. Uma vez obtida a seqüência da LaTRF, o inserto contendo o gene foi subclonado direcionalmente e na mesma fase de leitura do vetor de expressão bacteriano (pMAL-c5x, NEB) para obtenção e futura purificação da proteína recombinante. Verificou-se a expressão da proteína recombinante LaTRF utilizando SDS-PAGE e “Western Blot”. Pelos resultados obtidos na análise de expressão em pequena escala da proteína recombinante, foi observado possíveis indícios de que esta esteja sendo expressa. Com isso, torna-se possível a tentativa de uma expressão em grande escala utilizando esse mesmo sistema bacteriano (pMAL) a fim de se obter a proteína purificada que poderá ser futuramente utilizada para ensaios de “pull-down” dentre outras aplicações