Dissertation
Desenvolvimento da PCR em tempo real para amplificação do gene da Enzima Málica (ME) em isolados de Giardia duodenalis
Fecha
2010Registro en:
RAMOS, Nathália Motta Delvaux. Desenvolvimento da PCR em tempo real para amplificação do gene da Enzima málica (ME) em isolados de Giardia duodenalis. 2010. 114 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2010.
Autor
Ramos, Nathália Motta Delvaux
Institución
Resumen
Giardia duodenalis (G. duodenalis) é um protozoário entérico patogênico distribuído
mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mamíferos, incluindo
humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade genética,
apresentando sete genótipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os
genótipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial
zoonótico do parasito. Análise das sequências de amplicons de determinados
marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G.
duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta
desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima málica (ME)
comparando os resultados obtidos com o gene da β-giardina (βg) usando a PCR
convencional seguida de sequenciamento para detecção e genotipagem de
amostras clínicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar,
quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes.
Foram usadas 100 amostras clínicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo
exame parasitológico e imunológico.
A N - PCR convencional - βg amplificou 61%
destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como
genótipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16
humanos e três caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove
amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao genótipo A, sendo seis humanas
(quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo
indeterminado) e três caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por
ambos marcadores, observou-se concordância na identificação do genótipo. A
comparação do limite de detecção da PCR convencional ME com a PCR em Tempo
Real - ME demonstrou que esta última foi aproximadamente 10 4 vezes mais
sensível. Análise estatística dos resultados obtidos com as réplicas da curva-padrão
indicou reprodutibilidade do método e determinou que amostras negativas são
aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras clínicas (71%) foram
positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62
(87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantificação relativa
de DNA de G. duodenalis nas amostras clínicas com a PCR em Tempo Real - ME,
demonstrou que a concentração de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21
ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME
apresentou maior sensibilidade em relação à N - PCR convencional - ME, indicando
a necessidade de utilização de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se
em regiões polimórficas, como demonstrado pela análise das sequências de ME.
Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho
indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos
estudos de epidemiologia molecular da giardíase.