Dissertation
Ensaio imunoenzimático para o diagnóstico da hepatite A utilizando IgY anti-HAV
Fecha
2010Registro en:
SILVA, Alexandre dos Santos da. Ensaio imunoenzimático para o diagnóstico da hepatite A utilizando IgY anti-HAV. 2010. 104 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2010.
Autor
Silva, Alexandre dos Santos da
Institución
Resumen
A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A
prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e
saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado
resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e
jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil
epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o
que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para
detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de
mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos
anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos
anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY),
encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm
varias vantagens quando comparadas com IgG: alta resposta contra antígenos
de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de
serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O
objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos
em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o
desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV
total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado.
Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo:
vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de
Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA.
Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com
polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para
determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua
especificidade e título foram determinados à partir de um teste
imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi
estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado. Para
avaliar o ensaio imunoenzimático “in-house” com IgY anti-HAV, foi avaliado um
painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti-
HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por
SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração
de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado
com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O
ensaio “in-house” apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 79% e
eficiência de 81,5%. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e
sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático
“in-house” IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A
produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com
obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático “in house” com IgY anti-
HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios
imunoenzimáticos.