Evaluación de la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación en espermatozoides congelados de perro

Abstract

Una fecundación exitosa depende, entre otras cosas, de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la reacción acrosómica. Este fenómeno es esencial para una adecuada interacción gamética y posterior fecundación del ovocito. El espermatozoide de perro al ser sometido a criopreservación puede verse afectado alterando negativamente este proceso y por tanto, su capacidad fecundante. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides congelados de perro a través de la actividad enzimática de la acrosina, mediante dos métodos de evaluación: hidrólisis de gelatina en placa y por espectrofotometría, la hidrólisis de esteres de bajo peso molecular (BAEE). La obtención de semen se realizó a partir 5 machos adultos sanos, mediante estimulación manual del pene. Se utilizó la segunda fracción espermática de cada eyaculado, midiendo su volumen en copa recolectora y la motilidad espermática se evaluó en forma subjetiva al microscopio de contraste de fases. La concentración espermática se determinó mediante recuento en la cámara de Neubauer, de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. Se trabajó con semen fresco (control) y semen congelado proveniente de los mismos machos. El pellet obtenido de cada muestra se ajustó a una concentración de 200x106 de esp/ml, incubándolas por períodos de 0, 30, 60 y 90 minutos a temperatura ambiente (21°C) para inducir la capacitación de los espermatozoides. Luego de cada tiempo de capacitación se realizó la medición de la actividad enzimática de acrosina a través de hidrólisis de gelatina en placa y espectrofotometría de esteres de bajo peso molecular (BAEE). 7 Los resultados obtenidos en relación a la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación espermática en perros se describieron en términos de promedios, y se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se realizaron 5 replicas experimentales y se usó 1 eyaculado por perro en promedio. En relación al tipo de población espermática, los espermatozoides congelados y frescos (control) presentaron diferencias (P < 0,05) en relación al tamaño de los halos de digestión, observándose un diámetro promedio de halo mayor en espermatozoides frescos en comparación a los congelados de acuerdo a los tiempos de capacitación. Al evaluar la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de BAEE, se observó que durante los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos, la actividad enzimática de acrosina presentó variaciones (P<0,05) con mayor actividad enzimática en los espermatozoides a partir de los 60 min, mientras que en espermatozoides congelados la mayor actividad se observó al tiempo 0 de capacitación (no capacitados) (P <0,05). La actividad enzimática de acrosina en espermatozoides congelados sería menor que en los espermatozoides frescos, tanto en su actividad proteolítica en gelatina, como en espectrofotometría con BAEE. Además, la actividad de proacrosina/acrosina en espermatozoides caninos frescos se vería aumentada a través del tiempo de capacitación a diferencia de los espermatozoides congelados donde no se observó diferencias entre los diferentes tiempos de incubación en medio capacitante, por lo que se sugeriría que los espermatozoides frescos podrían retener mayores cantidades de acrosina que aquellos congelados/descongelados, lo que se traduciría en una acción más gradual en el tiempo observándose la mayor liberación de enzima entre los tiempos 60 y 90 minutos.