Detección y caracterización de proteínas priónicas en óbex de bovino mediante inmunotransferencia

Abstract

Existe un grupo de patologías neurodegenerativas letales que afectan a los humanos y a los animales denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). En los humanos, destaca la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (CJD), y la aparición en los últimos años de una nueva variante (nvCJD) que es causada por el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dentro de las EET animales, destaca el scrapie de ovinos y caprinos, y la BSE, que además de afectar al ganado bovino, es transmisible a los humanos. La teoría más aceptada sobre el agente etiológico de estas enfermedades es la teoría del prión, que corresponde a una proteína priónica patológica (PrPsc) resistente a proteasas, que se origina por un cambio conformacional de una proteína priónica celular del huésped (PrPc). La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) ha causado impacto mundial por el daño que ha provocado en la salud animal y en la economía, y por su relevancia en la salud pública al ser una enfermedad zoonótica. Durante años, el método de diagnóstico de rutina para la BSE fue el examen histopatológico del SNC de los bovinos sospechosos. Sin embargo, la epidemia desencadenada en Europa, principalmente en el Reino Unido, aumentó la necesidad de implementar métodos diagnósticos más rápidos y certeros. Esto originó el desarrollo de pruebas rápidas de diagnóstico, basadas en técnicas de inmunodetección del agente patológico (PrPsc) como es la inmunotransferencia o western blot. El presente trabajo se orientó por una parte, a la purificación, caracterización y detección inmunológica de proteínas priónicas en óbex de bovinos, mediante la utilización de la inmunotransferencia. Para obtener la PrPc, se utilizó un método de purificación de proteínas priónicas, y en el caso de la PrPsc se utilizó una proteína priónica recombinante (PrPrec); además, se evaluó la respuesta de ambas proteínas frente a la actividad enzimática de la proteinasa K. Para la posterior caracterización y detección inmunológica de estas proteínas, se realizó una electroinmunotransferencia. Por otra parte, para evaluar un método rápido de diagnóstico que detecte el agente de la BSE, se utilizaron 84 muestras de óbex de bovinos provenientes de mataderos de la Región Metropolitana, las que se analizaron individualmente por Western Blot mediante un kit comercial (Prionics Check-Western), aceptado y utilizado internacionalmente para el monitoreo y diagnóstico de esta enfermedad. Los resultados del presente estudio muestran la caracterización y detección inmunológica de la PrPc y la PrPrec mediante la inmunotransferencia. Además, se demuestra la sensibilidad a la digestión de ambas proteínas con la proteinasa K, lo que las diferencia de la PrPsc, que es una proteína proteasa resistente. En cuanto a los resultados obtenidos con el kit (Prionics Check-Western), de las 84 muestras analizadas 60 arrojaron un resultado negativo a BSE, ya que no se detectó inmunológicamente la PrPsc. El resto de las muestras (24) fueron analizadas nuevamente por dar resultados inconclusos, al aparecer bandas en el rango de peso molecular de la PrPsc. Sin embargo, finalmente el total de las muestras (84) arrojaron resultados negativos a BSE, lo que indica que las muestras inconclusas eran falsas positivas originadas por una deficiente digestión enzimática de la PrPc. La importancia de esta memoria de título radica en el hecho de ser pionera en la caracterización e inmunodetección de las proteínas priónicas de bovinos utilizando la inmunotransferencia, y en lograr la utilización e implementación en nuestro país de un método de diagnóstico rápido para BSE basado en un kit comercial, que es utilizado y aceptado internacionalmente para la detección del agente etiológico de esta patología