Caracterización de las respuestas biológicas inducidas por el plasma rico en plaquetas durante la reparación tisular

Abstract

Se ha propuesto el empleo de factores solubles derivados de plaquetas con el objeto de promover la reparación de tejidos. A pesar que diversos estudios han evaluado la respuesta de células gingivales y periodontales a fracciones derivadas de plaquetas, existe un fuerte debate acerca de los efectos ejercidos por estos factores sobre respuestas celulares relacionadas con la reparación tisular. En la presente tesis hemos evaluado la respuesta de cultivos primarios de fibroblastos gingivales de origen humano (FG) estimulados con Plasma rico (PRP) y pobre en plaquetas (PPP). Se evaluaron diferentes respuestas celulares que incluyen la contracción de geles de colágeno, migración celular, diferenciación miofibroblástica, producción de moléculas de matriz extracelular (MEC) y de enzimas proteolíticas. Para la contracción de geles se utilizaron cultivos tridimensionales de fibroblastos incorporados en colágeno en presencia de inhibidores de mateloproteasas de matriz y de la polimerización de actina. La producción de moléculas de matriz y de proteasas fue evaluada mediante Western-blot. La actividad de la GTPasa RhoA fue evaluada mediante un ensayo de “pull-down”. La distribución de actina y de contactos focales fue analizada mediante inmunofluorescencia. Los niveles de TGF-beta1 fueron cuantificados mediante ELISA. Tanto el PRP como PPP estimularon la contracción de geles de colágeno, proceso que fue revertido por los inhibidores de MMPs y de la polimerización de actina. PRP y PPP estimularon los niveles de MT1-MMP y TIMP-2, la activación de RhoA y la remodelación del citoesqueleto de actina. Ambas formulaciones estimularon la migración celular evaluado mediante tres ensayos funcionales tales como la migración desde explantes de tejido gingival, la migración en nido y en sistemas bi-camerales. PRP y PPP estimularon la diferenciación miofibroblástica, medida a través de la producción de α-SMA, Fibronectina EDA, colágeno tipo I y periostina. A pesar que TGF-beta1 se encontró más concentrado en PRP en comparación con PPP, la via de señalización Smad fue similarmente activada por ambos preparados. El presente estudio muestra que los factores solubles derivados de PRP y PPP pueden ejercer respuestas celulares similares compatibles con la promoción de la reparación tisular gingival. Más aun, estos resultados sugieren que PPP podría tener una acción terapéutica que debería ser estudiada en el futuro.

Platelet derived soluble factors have been proposed as a therapeutic agent to promote tissue repair. Although several studies have assessed the response of gingival and periodontal cells to platelet derived fractions, there still strong debate about the specific role played by these agents on cell responses involved in wound healing. In the present thesis we have evaluated the response of primary cultures of human gingival fibroblasts (GF) stimulated with Platelet rich (PRP) and poor plasma (PPP). Different cells responses including collagen matrix contraction, cell migration, myofibroblastic differentiation, production of matrix molecules and proteolytic enzymes were evaluated. Collagen matrix contraction was assessed using fibroblasts-populated collagen lattices in the presence of matrix metalloproteinases and actin polymerization inhibitors. Production of matrix molecules and proteinases was assessed through Western-blot. RhoA activity was evaluated by means of a pull-down assay. Actin distribution and focal adhesions were assessed through immunofluorescence. TGF-beta1 levels were quantified through ELISA. Both PRP and PPP stimulated gingival fibroblasts-populated collagen gel contraction. Moreover, Ilomastat and cytochalasin D inhibited this response. PRP and PPP stimulated MT1-MMP and TIMP-2 production, RhoA activation and actin cytoskeleton remodeling. Both formulations stimulated cell migration as assessed through gingival tissue explants immersed within collagen gels, nested cell migration assays and Transwell migration experiments. PRP and PPP stimulated myofibroblastic differentiation determined through α-SMA, EDAFN, type I collagen and periostin production. Although TGF-beta1 was more concentrated in PRP when compared to PPP, the Smad pathway was similarly activated by both formulations. The present study shows that soluble factors derived from PRP and PPP may exert a similar cellular response compatible with the promotion of wound remodeling in gingival fibroblasts. Moreover, our results suggest that PPP may be studied as a useful therapeutic agent to modulate gingival tissue healing.