Con el objeto de determinar la presencia de β-lactamasas tipo TEM en cepas clínicas y ambientales de Acinetobacter sp., aisladas del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes (IAHULA), Mérida, estado Mérida, se estudiaron 43 cepas, 20 correspondían a Acinetobacter baumannii y 23 a Acinetobacter RUH 1139, dichas cepas fueron obtenidas de pacientes recluidos en la unidad de cuidados intensivos de adultos y en la unidad de alto riesgo neonatal y previamente identificadas, tanto bioquímica como molecularmente. La susceptibilidad de las mismas frente a 14 β-lactámicos ensayados, se determinó mediante la prueba de difusión en disco. La investigación de β-lactamasas se realizó mediante la prueba de nitrocefina, sinergismo de doble disco, isoelectroenfoque (pI) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Todas las cepas de A. baumannii fueron resistentes a ampicilina, piperacilina y cefoxitin, el 95% fué resistente a cefotetan y cefuroxime; mientras que los carbapenemos fueron los antimicrobianos más activos. En el caso de las cepas identificadas como Acinetobacter RUH 1139, el 100% mostró resistencia ante ampicilina y cefamicinas, mientras que la ampicilina sulbactam y los carbapenemos fueron los agentes antimicrobianos más activos. Por la prueba de nitrocefina y punto isoeléctrico, tanto en las cepas de A. baumannii como las de Acinetobacter RUH 1139 fueron productoras de β-lactamasas. Se detectó una β-lactamasa con pI >9 en todas las cepas estudiadas, y una β-lactamasa con pI de 5.4 en todas las cepas de A. baumannii, pero no en las cepas de Acinetobacter RUH 1139. El gen que codifica para β-lactamasas tipo TEM fue hallado solo en las cepas de A. baumannii.