Con el objetivo de caracterizar las bacterias presentes en muestras de leche mastíticas de vacas Girolando (Mestizas Holstein-Gyr), procedentes de un rebaño con una historia de mastitis clínica de 6 meses y baja en la producción lechera, se empleó la técnica PCR-DGGE usando como marcador la región V3 del ADNr 16S, la cual es una metodología independiente de cultivo bacteriológico. La valoración de mastitis sub clínica se realizo por medio de CMT y las muestras se tomaron de vacas que tenían al menos 4 semanas sin terapia antibiótica. Las alícuotas fueron usadas para bacteriología e identificación molecular. Solo se seleccionaron las muestras negativas a cultivo para hacer la PCR-DGGE. El valor de mastitis sub-clínica por CMT al momento de la toma de muestra fue de 48.07% (225 cuartos). El PCR-DGGE permitió evidenciar la presencia de varios tipos de bacterias en las muestras estudiadas, las cuales se relacionaron más estrechamente a bacterias de los filos Firmicutes y Proteobacterias, donde destacó la presencia del género Acinetobacter. Muchos de estos microorganismos están implicados en multi-resistencia antibiótica, por lo cual la técnica se convierte en una herramienta útil para analizar estas poblaciones microbianas en vacas con mastitis clínica y cultivo negativo y establecer mejores medidas de control y prevención contra esta patología en las fincas lecheras. Se requieren otros estudios para establecer las posibles implicaciones de los microorganismos aislados sobre la salud humana y animal.92-103agustinarojas@yahoo.comambolivar@hotmail.comIn order to characterize the composition of bacteria in samples of milk from crossbreed Gyr–Holstein cows affected with mastitis, from a herd with a history of clinical mastitis from six months ago and low milk production, a culture-independent PCR - DGGE technique using as a marker the V3 region 16S rDNA was carried out. The assessment of sub clinical mastitis was performed by CMT. Samples were taken from cows that had a least 4 weeks without antibiotic therapy, and aliquots were used for bacteriology and molecular identification. Only culture negative samples were selected for PCR - DGGE. The level of sub clinical mastitis by CMT at the moment of sampling was 48.07 % (225 quarter). PCR-DGGE, revealed the presence of several types of bacteria in the samples studied, which were more closely related to bacteria of the Firmicutes and Proteobacteria phylum, which highlight the presence of the genus Acinetobacter. Most of these microorganisms are involved in antibiotic multi-resistance, so the technique becomes a useful tool for analyzing these microbial populations in cows with clinical mastitis and negative culture and establish better recommendations for control and prevention of this pathology in dairy farms. Others researches are needed to determine the implications of microorganisms isolated in this work over animal and human health.