Tesis Doctorado
Regulación de la expresión y actividad del transportador equilibrativo de nucleosidos tipo 2 por insulina en endotelió microvascular de placenta humana de diabetes gestaciónal mediante la expresión diferencial de los receptores de insulina tipo a y b
Autor
Sobrevia, Luis
Pontificia Universidad Católica de Chile
Institución
Resumen
La Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) está asociada con altos niveles deadenosina en plasma fetal y disminución del transporte total de adenosina en el endoteliomacrovascular de vena umbilical humana. El transporte de adensosina es mediado por lostransportadores equilibrativos de nucleósidos tipo 1 (hENT1) y 2 (hENT2), queresponden a la regulación diferencial por insulina en HUVEC de DMG. Más aun, se haplanteado que esta hormona media sus efectos a través de la expresión diferencial de lasisoformas del receptor de insulina tipo A (IR-A) y tipo B (IR-B); sin embargo, el papel de insulina, IR-A e IR-B en la regulación del transporte de adenosina en endoteliomicrovascular de placenta humana (hPMEC) ya sea de embarazos normales o de DMG,aun no ha sido establecido.Pacientes con embarazo normal (n=64, grupo control) y diagnosticados con DMG(n=64, TTGO >140 mg/dL, tratados con dieta) fueron incluidos en los estudiosdesarrollados en esta tesis doctoral. Sangre materna y de cordon umbilical fueronobtenidas para evaluar los parámetros de resistencia a la insulina (HOMA-IR), función de la célula β y sensibilidad a la insulina (HOMA-IS). hPMEC fueron aisladas y cultivadasbajo condiciones estándares y expuestas a diferentes concentraciones y tiempos deinsulina (0.01-10 nmol/L, 0-24 horas), para luego realizar ensayos de transporte deadenosina (10 μmol/L adenosine, 4 μCi/mL [3H]adenosina, 22ºC), abundancia deproteína y expresión del mRNA para hENT1 y hENT2 mediante ensayos de western bloty PCR en tiempo real. La actividad transcripcional de dos fragmentos (pGL3-hENT2-1491, pGL3-hENT2-602) de una región promotora de SLC29A2 (para hENT2) fue cuantificada mediante el ensayo de luciferasa. Para evaluar las vías de señalización de insulina se cuantificó la expresión de IR-A e IR-B, fosforilación de p42/44mapk y Akt, y actividad delos factores de transcripción SREBP-1c y hCHOP mediante PCR en tiempo real, westernblot y ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Además, se determinó laactividad de la óxido nítrico sintasa mediante la formación de L-citrulina. Para evaluar la participación de IR-A e IR-B en los efectos de insulina, se diseñó siRNA (Ad-IR-A o Ad-IR-B) para inhibir selectivamente la expresión de las isoformas del receptor de insulina.Los resultados muestran que DMG se asocia con un aumento en la concentraciónde adenosina en sangre de vena umbilical sin cambios en sangre arterial, y con unadisminución del transporte de adenosina mediado por hENT1 y hENT2. Paralelo a estosresultados se observó que las razones de mRNA de IR-A/IR-B y actividadP~44/42mapk/P~Akt se encuentran disminuidas (fenotipo metabólico) en hPMEC deDMG. Insulina revierte los efectos de DMG sobre IR-A/IR-B y P~44/42mapk/P~Akt avalores obervados en células normales (fenotipo mitogénico), y aumenta la actividad detransporte de adenosina vía hENT2. Estos efectos de insulina fueron bloqueados encélulas cuya expression de IR-A o IR-B fue silenciada (knowckdown). Además, insulinaaumentó la actividad transcripcional del gen SLC29A2 (para hENT2) involucrando a losfactores de transcripción SREBP-1c y hCHOP-C/EBPα en este fenómeno, efecto que fuebloqueado al silenciar IR-A e IR-B, respectivamente. Los resultados de esta tesismuestran que DMG cursa con disfunción endotelial microvascular en la circulación fetoplacentaria humana. Insulina requiere de la expresión de IR-A e IR-B estimulando enforma diferencial sus vías de señalización asociadas y, de esta forma, restableciendo unfenotipo mitogénico (normal) desde el fenotipo metabólico observado en hPMEC deembarazos que cursaron con DMG.