Tesis Doctorado
Determinantes estructurales y funciónales que definen las propiedades cinéticas y regulatorias de los transportadores de acido ascórbico svct1 y svct2
Autor
Vera-C, Juan Carlos
Universidad de Conecpción
Institución
Resumen
El ácido ascórbico es transportado al interior celular por los transportadores de Na+-ácido ascórbico, SVCTl y SVCT2, a favor del gradiente electroquímico del Na+.Ambos transportadores son altamente similares, con una identidad de secuencia mayor al 65% y patrones de hidrofobicidad consistentes con una estructura secundaria de 12 hélices transmembrana. Dado que ambos transportadores son activados cooperativamente por el Na+ en forma similar, el principal criterio funcional utilizado hasta ahora para diferenciarlos es la Km de transporte de ácido ascórbico.Estudios recientes de nuestro laboratorio indican que para SVCT2, el Na+ afectala Km de transporte de ácido ascórbico, el ácido ascórbico afecta la cooperatividad por el Na+ y los cationes bivalentes Ca2+ y Mg2+ son esenciales para la función deltransportador. SVCT1, por otro lado, es activo en la ausencia de cationes bivalentes. De acuerdo a lo anterior, proponemos que las propiedades funcionales de SVCTl y SVCT2 son moduladas diferencialmente por los sustratos Na+ y ácido ascórbico y por cationes bivalentes, y que SVCTl y SVCT2 poseen sitios de unión de cationes bivalentes que son responsables de su sensibilidad diferencial al Ca2+ y al Mg2+.En el contexto anterior, llevamos a cabo un estudio detallado de SCVTl ySVCT2, expresados en células HEK-293 como proteínas de fusión con la proteínafluorescente verde y realizamos estudios de transporte de ácido ascórbico bajo distintas condiciones experimentales para establecer de que modo el Na+, el ácido ascórbico, el Ca2+ y el Mg2+ afectan las propiedades de ambos transportadores y determinan sus diferencias funcionales. 1) Analizamos el efecto del Na+ sobre el transporte de ácido ascórbico examinando el grado de cooperatividad (nH, Na50 y RNa) y su efecto sobre las constantes cinéticas de transporte (Km y V max). ii) Analizamos de que modo el ácidoascórbico afecta la activación por el Na+ (nH, Naso y RNa). iii) Determinamos lageneración de corrientes de Na+ inducidas por el ácido ascórbico. iv) Examinamos elefecto del Ca2+ y el Mg2+ sobre el transporte de ácido ascórbico (Km y V max) y la cooperatividad por el Na+ (nH, Naso y RNa). v) Utilizamos análisis de secuencia,introducción de mutaciones sitio-dirigidas y la construcción de una proteína quimérica para establecer la presencia de posibles sitios exofaciales de unión de Ca2+ responsables de la sensibilidad de SVCTl y SVCT2 al Ca2+ y al Mg2+.Los resultados de estos estudios revelaron que: i) El Na+ modula la función deSVCTI y SVCT2 afectando diferencialmente el valor de la Km de transporte de ácidoascórbico, con una curva de concentración-respuesta desplazada hacia menoresconcentraciones en el caso de SVCT2. ii) El ácido ascórbico modula la función deSVCTl y SVCT2 afectando diferencialmente la capacidad del Na+ para activar en formacooperativa el transporte de ácido ascórbico. Para SVCTl, el Na+ activa el transporte en forma cooperativa a todas las concentraciones de ácido ascórbico, mientras que para SVCT2 se pierde la cooperatividad y luego se hace totalmente independiente del Na+ a elevadas concentraciones de ácido ascórbico. iii) El Ca2+ y el Mg2+ modulan diferencialmente la función de SVCTl y SVCT2 debido a que SVCT2, pero no SVCTl, posee un dominio de unión de Ca2+ de tipo EF-Hand localizado en el lazo extracelular que conecta los dominios transmembrana III y IV. Este dominio corresponde a la secuencia 191DVSV ANGTAELLHT204 . Su inactivación por mutagénesis sitio-dirigida convierte a SVCT2 en un transportador con propiedades tipo-SVCTl y su introducción en SVCTl genera un transportador quimérico que se acumula intracelularmente.