Modulación de la sinapsis inhibitoria gabaérgica por la vía de señalización wnt

Abstract

Sistema nervioso central de vertebrados. Los receptores para GABA son clasificados en 3 grupos: GABAA, GABAB y GABAc. Esta tesis está enmarcada en el estudio de los receptores GABAA (GABAA-Rs). Estos receptores son canales iónicos heteropentaméricos activados porligando compuestos principalmente de subunidades ?,? y ?2. Los GABAA-Rs son blancos de acción de múltiples drogas y han sido involucrados en diversas neuropatologías tales como laepilepsia, trastornos de ánimo, depresión y alcoholismo. Se cree que la agregación postsináptica de los receptores es esencial para la transmisión sináptica. Sin embargo, losmecanismos involucrados en modulación del agrupamiento post-sináptico de los GABAA-Rs no son bien entendidos. Nosotros proponemos que la vía de señalización Wnt podría ser importante en la regulación del tráfico y estabilidad de los GABAA-Rs. La vía de señalización Wnt es esencial para el desarrollo neuronal y para el mantenimiento del sistema nervioso.Previamente, nuestro laboratorio demostró que la señalización Wnt modula la función sináptica. El ligando Wnt-7a regula la localización sináptica, el número y tamaño de las agrupaciones del receptor de acetilcolina nicotínico ?7 (?7-nAChR). El ?7-nAChR es un miembro de la superfamilia de canales iónicos activados por ligando que también comprende a los GABAA-Rs. Esta tesis intentará dilucidar la contribución de las vías Wnt canónica y/o no canónicas en la localización sináptica de los GABAA-Rs. Nuestra hipótesis es: "La Vía de señalización Wnt modula la transmisión sináptica inhibitoria regulando la expresión de losGABAA -Rs en la superficie celular de neuronas hipocampales". El objetivo general de esta tesis es estudiar el papel de las vias de señalización Wnt sobre los niveles de los GABAA-Rsen la superficie neuronal y determinar su efecto sobre la transmisión inhibitoria en neuronas hipocampales.En primer lugar evaluamos los efectos dependientes del tiempo de tratamiento con ligandos clásicos canónicos (Wnt-3a and Wnt-7a) y no canónico (Wnt-5a y Foxy-5) en la expresión en la superficie de los GABAA-Rs en cultivo de neuronas hipocampales. Determinamos el número y tamaño de las agrupaciones de los GABAA-Rs, la localización sináptica de los receptores y las corrientes sinápticas mediadas por los GABAA-Rs. Evaluamosla participación de la síntesis de proteínas, de la endocitosis y del reciclaje en la modulación mediada por Wnt. Los resultados indican que Wnt-5a aumenta el número pero no el tamaño delas agrupaciones de los GABAA-Rs. A diferencia de los ligandos canónicos, tales como Wnt-3a y Wnt-7a, Wnt-5a aumenta la expresión en la superficie de los GABAA-Rs compuestos de las subunidades ?l y ?2. Este ligando también induce un fuerte, rápido y duradero aumento de la amplitud de las corrientes inhibitorias post-sinápticas evocadas (eIPSCs), mediadoexclusivamente por mecanismos post-sinápticos. Finalmente, demostramos que el aumento en la expresión de los GABAA-Rs en la superficie por Wnt-5a es debido a un aumento en el reciclaje de los receptores.Por otro lado, investigamos si Wnt-5a induce la expresión de los receptores en la superficie por la vía Wnt/JNK o por la vía Wnt/Ca2+. Usamos inhibidores para los tres efectores conocidos de estas vías: TAT-TI-JIP para inhibir la actividad de JNK en la vía Wnt/JNK, y K.N-93 y 056976 para inhibir las actividades de CaMKII y PKC de la víaWnt/Ca2+. Medimos el número de agrupaciones de los GABAA-Rs por ?m de neuritas en presencia de los inhibidores y de Wnt-5a. Encontramos que sólo en la presencia del inhibidor de CaMKII el efecto de Foxy-5 es completamente bloqueado. Para confirmar que la víaWnt/Ca2+ está implicada en el aumento de los GABAA-Rs funcionales, nosotros medimos las eiPSCs mediadas por los GABAA-Rs. Observamos que el efecto de Wnt-5a es completamente inhibido por KN-93. Estos resultados sugieren que CaMKII es el mediador principal de losefectos de Wnt-5a sobre los GABAA-Rs.En conclusión, el tratamiento con el ligando no canónico Wnt-5a aumentasignificativamente la cantidad de GABAA-Rs funcionales en la superficie celular, aumentando el número de las agrupaciones y la amplitud de las corrientes GABAérgicas. Además, la vía no canónica Wnt/Ca2+ es requerida para modular el reciclaje de los GABAA-Rs funcionales enneuronas hipocampales.