Tesis Doctorado
Characterizatión and use of retroviral internal ribosome entry segments (ires) for the development or bicistronic retroviral vectors for an efficient gene transfer
Autor
Darlix, Jean-Luc
spencer-Ossa, Eugenio
Universidad de Chile
Institución
Resumen
Los vectores retrovirales se han perfilado como uno de las herramientas más importantesen la transferencia de genes. De hecho, han permitido la transducción de genes conpotencialidad terapéutica a múltiples tipos celulares (G unzburg & Salmons, 1995; Salmons etaL., 1995). Diversas estrategias de transferencia génica actualmente en desarrollo requieren de una expresión simultanea de más de un producto proteíco. El uso de elementos génicos tales como los segmentos de entrada interna de ribosomas, IRES (interna) ribosomal entry segment) han demostrado ser una de las formas más eficientes para expresar dos genes exógeneos en una célula. Inicialmente descrito en picornavirus, los IRES son estructuras de ARN capaces dereclutarlos factores necesarios para la iniciación de la traducción de manera independiente a laestructura cap, característica de los ARN mensajeros eucarióticos. La utilización de IRES de picornavirus en la construcción de vectores ha permitido la traducción de un mensajero policistrónico en un sistema eucariótico (Ada metaL., 1991). Diversos estudios han reportado la presencia de un IRES en la región 5' no traducida (UTR), "secuencia leader", de los retrovirus oncogénicos murinos (MLV) FrMLV, MoMLV y HaMSV (Berlioz & Darlix, 1995; Berlioz et al., 1995; Vagner et al., 1995b). Las regiones leader de los virus MLV no presentan homología de secuencia sin embargo, la estructura de esta región es conservada entre todos los retrovirus de tipo MLV y MLV-like(Koning et al., 1992). Basados en estudios de homología estructural se estableció como hipótesis que los retrovirus MLV-like presentaba un IRES en su secuencia 5'leader. Como modelos de estudio se seleccionó el retrovirus de la reticuloendoteliosis aviar desubtipo A (REV-A) y el retrotransposon de ratón Vl30 (VL30m). El presente trabajo describe la caracterización del IRES presente en la secuencia5' leader del virus REV-A y aquel presente en la región 5' UTR VL30m. Ambos IRESes han sido utilizados en el desarrollo de nuevos vectores retrovirales bicistronicos de tipo MLV-IRES de alto título. La actividad de los IRES y utilidad de los vectores ha sido evaluada en diferentes tipos celulares. Este estudio muestra que en el sistema nervioso central (SNC) la actividad de los IRESes de origen viral no esta regulada por el estado de diferenciación celular. Por tanto, los vectores desarrollados abren nuevas posibilidades en el diseño de estrategias de terapia génica para SNC. Finalmente, se evaluó laactividad del IRES de MoMuLV en el contexto viral. Los resultados indican que el virus puedeutilizar el IRES para dirigir la síntesis de las proteínas virales y de esta manera escapar al controlimpuesto por la célula a nivel de la iniciación de la traducción.