El receptor frizzled-1 media la protección del ligando wnt3a de la neurotoxicidad inducida por oligómeros abeta en células pc12 y neuronas de hipocampo

Abstract

La vía de señalización Wnt está involucrada en procesos fundamentales, como la proliferación, destino celular y desarrollo; alteraciones en algunos de sus componentes se ha relacionado al desarrollo de cáncer y recientemente se la ha relacionado con el desarrollo de desórdenes neurodegenerativos, como desorden bipolar, esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer. Nuestro laboratorio ha demostrado que la activación de la vía de señalización Wnt canónica por el ligando Wnt3a protege a neuronas de hipocampo de rata de la neurotoxicidad inducida por fibras del péptido A. Sin embargo, el receptor del ligando Wnt3a que media su efecto neuroprotector no se ha identificado. Se sabe que Wnt3a smergiza con el receptor Frizzled-1 humano y debido a la alta homología aminoacídica entre este receptor y su homólogo de rata, en esta tesis se planteó la hipótesis que la neuroprotección que ejerce Wnt3a de la toxicidad inducida por el péptido AÍ3 es mediada por el receptor FzI de rata. Para esto nos planteamos como objetivo general estudiar el efecto protector de Wnt3a cuando se modulan los niveles de expresión de Fzl o Fz2 (receptores canónico y no canónicos, respectivamente) en células PC 12 y en neuronas de hipocampo de rata. Para llevar a cabo esto, nos propusimos: (1) determinar cuáles son los Fz que se expresan en células PCl2 no diferenciadas, en neuronas de hipocamapo en cultivo y en corteza e hipocampo de rata adulta, además de determinar su localización en el cerebro de rata y ratón adultos; (2) para determinar la participación de Fz en la activación de la vía por Wnt3a, sobreexpresamos Fzl o Fz2 en células PC12 y analizamos la estabilización de f3-catenina y transcripción de ciclina Dl en presencia de Wnt3a o Wnt5a; (3) luego evaluamos el efecto protector de Wnt3a de la neurotoxicidad inducida por oligómeros de AJ3 en células que sobreexpresan Fzl o Fz2, determinando tanto la sobrevida celular por reducción de MU como la aparición de eventos apoptóticos a través de la activación de caspasa-3; (4) de acuerdo a los resultados obtenidos, se realizaron luego experimentos de pérdida de función, utilizando oligonucleótidos antisentido contra Fzl, tanto en células PC] 2 como en neuronas de hipocampo en cultivo, evaluando la sobrevida celular y la actividad de caspasa-3 y analizando además la morfología de las neuronas expuestas a los oligómeros A3 y Wnt3a. Los resultados muestran que los mRNA de la mayoría de los receptores fr se expresan en los tejidos y células analizados. Los receptores Fzl y Fz2 se expresan ampliamente en el cerebro de rata y ratón, especialmente en la formación hipocampal y además se expresan en neuronas de hipocampo en cultivo. El ligando Wnt3a activa la vía Wnt canónica en células PC1 2, estabilizando -catenina y aumentando los niveles de transcrito para ciclina Dl, efectos que no fueron observados con el ligando Wnt5a. Encontramos también que el ligando Wnt3a protege a las células PC 12 y a neuronas de hipocampo de la toxicidad inducida por oligómeros A13 , efecto que fue inhibido por sFRP-1, una proteína que impide la unión del ligando a su receptor. En contraste, el efecto protector no fue observado cuando se utilizó el ligando no canónico Wnt5a. Además, Wnt3a disminuye la activación de caspasa-3 inducida por los oligómeros A13. Éstos disminuyen la cantidad total de -catenina, lo que fue prevenido por Wnt3a en células PCl2. Es importante destacar que el ligando Wnt5a presente en el medio condicionado es funcional, ya que induce en células PCl2 la fosforilacion de Dishevelled-3, una proteína que se encuentra río debajo de Fz y cuya fosforilación se requiere para la activación de la vía Wnt. En experimentos de ganancia de función en células PCl2, encontramos que la sobreexpresión de Fzl, pero no de Fz2 en células PCl2, aumenta la estabilización de -catenina y los niveles de transcrito de ciclina Dl inducidos por Wnt3a. Junto a esto, la sobreexpresión de Fzl, pero no de Fz2, aumentó significativamente la sobrevida de células PCl2 inducida por el ligando Wnt3a, además de disminuir la activación de la caspasa-3. Por el contrario, al disminuir la expresión de Fzl por oligonucleótidos antisentido contra este receptor, el efecto de Wnt3a sobre la activación de la vía WntJí3- catenina fue reducido significativamente. Así mismo, el efecto protector de Wnt3a contra la neurotoxicidad inducida por oligómeros Ap es parcialmente inhibido cuando la expresión de Fzl fue disminuida en células PCl2 y en neuronas de hipocampo en cultivo. Finalmente, cuando los cultivos de neuronas de hipocampo son expuestos a oligómeros A3 se observa una significativa pérdida de la red neuronal y una importante degeneración de las neuritas, efecto que es prevenido por Wnt3a. Los resultados de esta tesis demuestran que el receptor Fzl participa en la acción neuroprotectora de Wnt3a; además, modificando los niveles de expresión de Fzl la respuesta celular al ligando Wnt3a puede ser modulada. Esto apoya la idea de que Fzl es el receptor para el ligando Wnt3a.