Gen de la citotoxina vaca de helicobacter pylori: genotipos presentes en cepas Chilenas y estudios del sistema secretor como modelo presentador de antígenos heterólogos en la superficie de una cepa vacuna

Abstract

La bacteria Gram negativa Helicobacter pylori es un enteropatógeno que tiene como hospedero natural al ser humano. En los últimos años se ha encontrado una correlación entre dicha bacteria y una serie de enfermedades que afectan el tracto digestivo como son la gastritis crónica, úlcera péptica, incluso el cáncer gástrico. Con el desarrollo de nuevas técnicas en biología molecular se ha podido secuenciar el genoma completo de H. pylori y con esto, comenzar el estudio de la caracterización genética total de esta bacteria. Una de las principales características de H. pylori vinculada a la patogenicidad es la síntesis de la toxina VacA, la cual es secretada al espacio extracelular por un sistema autotransportador de tipo V que no ha sido bien estudiado. Una vez en el lumen del estómago del hospedero, VacA puede provocar vacuolización en las células epiteliales del estómago, causando degeneración del epitelio gástrico, con el consecuente desarrollo de las enfermedades antes mencionadas. Estudios efectuados los últimos 10 años que comprenden análisis de las secuencias genéticas de vacA en diversos aislados de H. pylori en el mundo, han demostrado la variabilidad que presenta dicho gen asociada a regiones específicas, lo cual se adjudica a la notable capacidad de transferencia de genes entre cepas e intercambio genético mediado por eventos de recombinación. Es así como se reconocen dos zonas bien definidas y altamente variables en la proteína VacA: una región ubicada en el péptido señal (s) y una región media (m), lo cual permite diversas combinaciones entre las variables alélicas de cada región. Esta variabilidad se ha asociado al grado de patogenicidad de las cepas aisladas como a los cuadros clínicos provocados en el hospedero. En Chile, donde se estima que al menos el 70 % de la población está infectada con este patógeno, no existen estudios acabados de variantes predominantes de VacA a nivel nacional, cuyo conocimiento sería muy ventajoso para conocer la naturaleza de las cepas a las cuales se enfrenta nuestra población además de ser un antecedente útil en el diseño de estrategias para el control del patógeno en la población, mediante el uso de vacunas orales vivas en infantes, como también en adultos ya infectados. La presente tesis tuvo por objetivos centrales el estudio del gen vacA en aislados chilenos, el estudio del sistema secretor de la toxina y proponer la utilización de este como presentador de antígenos además de efectuar ensayos preliminares de vacunación contra H. pylorí en ratones. Para esto se evaluaron las cepas de H. pylori más representativas obtenidas de biopsias de pacientes chilenos enfermos de gastritis crónica, úlcera péptica y asintomáticos en diversos centros poblacionales de nuestro país, mediante PCR y secuenciación parcial del gen vacA para definir los alelos más frecuentes presentes en las cepas chilenas y establecer una correlación con la patología del paciente. Posteriormente se efectuaron estudios de destinación a la membrana externa con el carboxilo terminal de VacA (CT2) y se describió un nuevo modelo de secreción autopromovido para VacA. En base a esto se utilizaron las proteínas de H pylori HpaA y HP0231 como modelos para ser presentados en la superficie celular de Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Finalmente se evaluó la expresión de la fusión HP02311CT2 en la cepa vacuna S. typhimurium4550 y se efectuaron experimentos preliminares de vacunación en ratones con la fusión HP0231/CT2. La realización de esta tesis permitió: a) obtener un banco de cepas de H. pylori y datos con relevancia epidemiológica que hasta hoy no han sido recolectados en Chile (256 cepas), b) proponer un modelo de secreción para VacA en la membrana externa, c) utilizar un nuevo modelo de exposición de antígenos en la superficie bacteriana y d) probar preliminarmente el modelo de exposición de antígenos con la construcción HP0231/CT2 en una vacuna oral viva ensayada en un modelo animal. H.pylori es un problema de salud pública y este estudio servirá como etapa inicial para el diseño de una vacuna de uso humano, y nuestro modelo presentador de antígenos genéricos en membrana externa, para futuros usos en la prevención o tratamiento de otras infecciones bacterianas o virales.