Efecto del cobre sobre la expresión génica y propiedades de la proteína prión celular (prpc) en células neuronales

Abstract

Las enfermedades priónicas son patologías neurodegenerativas fatales que están asociadas al cambio estructural de la proteína prion celular (PrPc) rica en estructura de hélice a, hacia una conformación patogénica denominada PrPSc, rica en hoja β plegada. La función fisiológica de PrPc no se conoce, pero se ha sugerido su participación en el metabolismo de cobre principalmente debido a PrPC une y reduce este metal a través de su dominio Nterminal. Considerando que la expresión génica de proteínas involucradas en la homeostasis del cobre es estimulada por metales pesados, en esta tesis nos propusimos estudiar si la expresión del gen de PrPC (Prnp) es modulada por cobre. Se determinó que este metal induce la expresión de Prnp en cultivo primario de neuronas, lo que se estableció a nivel de mRNA y proteína. Además, cobre indujo fuertemente la actividad de un vector reportero de luciferasa bajo el control del promotor de Prnp de rata transfectado establemente en células PC 12, pero no en células gliales C6. Al analizar el efecto de otros metales pesados determinamos que cadmio también indujo la expresión de Prnp, mientras que zinc y manganeso no tuvieron efecto, indicando que Prnp es regulado en forma metal específica en células neuronales. A través de deleciones progresivas del promotor de Prnp, se determinó que la región que mediaba el efecto de cobre contenía un putativo elemento de respuesta a metales (MRE), que diverge de la secuencia MRE consenso en un nucleótido. A pesar de que por ensayos de retardo en la movilidad electroforética se demostró la unión de proteínas nucleares a una sonda conteniendo este putativo MRE, ensayos de supershfl sugirieron que este elemento no es un sitio de unión para MTF-1, que es el factor responsable de la activación de la transcripción a través de los MREs. Estos resultados sugieren que cobre induce la expresión de Prnp en neuronas y células PC 12 por un mecanismo independiente del factor transcripcional MTF- 1. Debido a que evidencias in vitro sugerían que el cobre podría estar involucrado en las alteraciones conformacionales de PrP c asociadas a su conversión a PrP, en esta tesis se evaluó además el efecto del cobre sobre las propiedades bioquímicas de PrPc en células neuronales. El metal indujo cambios en la solubilidad de PrP en neuronas hipocampales y células N2a, sugiriendo que a nivel celular cobre podría inducir alteraciones conformacionales o del plegamiento de PrP. A pesar de que la forma insoluble de PrP inducida por cobre presentaba un patrón de glicosilación alterado que sugería que cobre podría inducir la acumulación de formas inmaduras de PrP, el co-tratamientos con la enzima PIPLC, que corta el anclaje GPI liberando PrPc hacia el medio extracelular, sugirió que la forma insoluble de PrP no era retenida intracelularmente durante su proceso de biosíntesis. Además, se determinó que la insolubilidad inducida por cobre era reversible y no se asociaba a cambios en la sensibilidad de PrP a la digestión con proteinasa K (PK), difiriendo de dos propiedades características de la conformación PrP SC como son la capacidad de autopropagación y la resistencia a la digestión con PK. Estos resultados sugieren que a nivel celular cobre induciría cambios en las propiedades de PrPc no asociados a PrPSC.