Devido à natureza recalcitrante da biomassa, uma etapa normalmente essencial em uma biorrefinaria lignocelulósica, por rota bioquímica, é o pré-tratamento da matéria-prima. O presente trabalho teve como principal objetivo o estudo do pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com ácido fosfórico diluído de forma a encontrar as melhores condições em termos de solubilização de hemicelulose o que, por sua vez, facilita o acesso das enzimas à celulose, na etapa de hidrólise enzimática. Melhores condições de tratamento ácido foram comparadas com tratamento hidrotérmico. Realizou-se, também, a produção de enzimas celulolíticas através da utilização do micro-organismo Trichoderma reesei RUT C30 e hidrólise enzimática dos bagaços pré-tratados em diferentes condições, com as enzimas produzidas no laboratório e com enzimas comerciais (Celluclast® 1,5 L e Novozym® 188). Por fim, foi verificada a fermentabilidade do hidrolisado enzimático que apresentou o melhor resultado em termos de conversão de celulose em glicose. Na primeira etapa, o pré-tratamento foi realizado de acordo com um planejamento experimental 23, cujas variáveis estudadas foram: tempo (8–24 minutos), temperatura (144–186 ºC) e concentração de ácido fosfórico (0,05–0,20%, m/v). Pré-tratamentos adicionais foram realizados, a 186 ºC e 195 ºC, na ausência e na presença de ácido fosfórico (1%, m/v), por 8 minutos. Todos os pré-tratamentos foram realizados em uma reator batelada de 20 L (Regmed AU/E-20), com volume de trabalho de 10 L e carga de sólidos de 5% (m/v). A eficiência dos pré-tratamentos foi verificada através da comparação de análises físicoquímicas dos bagaços in natura e pré-tratados e da conversão de celulose em glicose por hidrólise enzimática. As hidrólises foram realizadas a 50 ºC e pH 4,8. A produção de enzimas se deu em meio de lactose (10 g/L) solubilizado em hidrolisado hemicelulósico, sendo conduzida em biorreator de bancada com volume útil de 2 L, agitação de 500 rpm, aeração de 2 vvm, temperatura de 28 ºC, pH 5,0, durante 48 horas. A fermentação alcoólica do hidrolisado enzimático foi realizada em biorreator de bancada, com volume útil de 1 L, a 35 ºC, pH 4,8, 300 rpm, utilizando-se a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238. Em relação ao planejamento experimental, os pré-tratamentos com H3PO4 0,20% a 186 ºC, durante 8 e 24 minutos, mostraram-se eficientes na remoção de hemicelulose, alcançando solubilizações de 96% e 98%, respectivamente. Modelos, preditivos e significativos, foram obtidos para as concentrações de celulose, hemicelulose e lignina, na fração sólida de bagaço, assim como para a hemicelulose solubilizada. Nos prétratamentos adicionais, as maiores solubilizações de hemicelulose foram de 97% e 98%, para os bagaços pré-tratados a 186 ºC e 195 ºC, com H3PO4 1% (m/v), respectivamente. A enzima produzida no laboratório apresentou-se eficiente na hidrólise dos bagaços prétratados, quando comparada às enzimas comerciais. Para ambos os tipos de enzimas, as maiores conversões de celulose em glicose foram obtidas a partir dos bagaços pré-tratados nas condições mais drásticas.