Pseudomonas aeruginosa é uma bacteria Gram-negativa ubíqua e oportunista. Na rotina hospitalar, os marcadores fenotípicos nem sempre revelam a diversidade das bactérias distribuídas nos diversos setores, assim, aplicamos três métodos moleculares baseados na amplificação por PCR do locus de rDNA e tDNA para caracterizar a diversidade genética de linhagens de P. aeruginosa isoladas em um hospital público em Recife-PE, Brasil. O rDNA-PCR detectou 15% de variabilidade genética, contra 23% do tDNA-PCR e 23% do Duplex-PCR. O setor com maior diversidade genética foi a Unidade de Tratamento Intensivo do hospital, o qual apresentou quatro genótipos bacterianos diferentes. A ocorrência de linhagens de P. aeruginosa pertencentes ao mesmo genótipo e mesmo perfil de resistência a múltiplas drogas (MDR), em diferentes setores do hospital, sugere que há infecção cruzada entre pacientes. Os dados apresentados pelo rDNA-PCR, tDNA-PCR e Duplex-PCR, em associação ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana provêem valiosas informações epidemiológicas para o controle de infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa