Introdução: O colesteatoma da orelha média é uma doença inflamatória crônica associada muitas vezes à destruição do osso temporal. Há bastante tempo é conhecida a possibilidade de indução de colesteatomas pela introdução de certos agentes irritantes na orelha média, como misturas de talco e fibrina ou quinino. O propilenoglicol foi, recentemente, considerado uma droga eficaz na indução experimental do colesteatoma e é bastante usada, atualmente, com este objetivo. A mitomicina C tem uma ação antiproliferativa sobre os fibroblastos e apresenta efeitos de diminuição do tecido cicatricial após as cirurgias otorrinolaringológica e oftalmológica. Objetivos: Determinar se a administração da mitomicina C poderia evitar que a exposição ao propilenoglicol induzisse na orelha média de ratos o colesteatoma e a otite média. Métodos: O estudo foi experimental controlado e pareado. Vinte e quatro ratos albinos da linhagem Wistar foram submetidos a um total de três injeções intratimpânicas a cada semana nas suas orelhas direitas (grupo controle) e esquerdas (grupo experimental). A solução injetada na orelha média direita continha 0,2 mL de propilenoglicol a 50%, 0,1 mL de sulfato de gentamicina (40 mg/mL) e 0,1 mL de soro fisiológico a 0,9%. A solução injetada na orelha média esquerda continha 0,2 mL de propilenoglicol a 50%, 0,1 mL de sulfato de gentamicina (40 mg/mL) e 0,1 mL de mitomicina C (0,5 mg/mL). Os animais foram mortos após dez semanas para exames otomicroscópico e de microscopia de luz. Resultados : Houve diferença com significância estatística entre os grupos controle e experimental, em relação ao espessamento da mucosa (p = 0,004) e à distribuição do espessamento da mucosa na bula timpânica (p = 0,038). Não houve diferenças com significância estatística entre os grupos controle e experimental, no que se relaciona à espessura da membrana timpânica (p = 0,371), à distribuição da espessura da membrana timpânica (p = 0,223), à distribuição da integridade da membrana timpânica (p = 0,219), à distribuição dos achados otomicroscópicos (p = 0,262), à presença do exsudato (p = 0,125), da fibrose (p = 1,000) e do colesteatoma (p = 0,687). Conclusão: A mitomicina C intratimpânica não foi eficaz para impedir na orelha média de ratos a formação de colesteatoma e otite média