Foram analisadas 15 linhagens de Metarhizium isoladas de diferentes regiões e hospedeiros quanto às características genéticas e 7 linhagens quanto a patogenicidade sobre Diatraea saccharalis. Os marcadores moleculares ITS (Internal Transcrided Spacer) do rDNA, Intron splice site primer, RAPD e Microssatélites (SSR-Simple Sequence Repeats) foram utilizados para avaliar a diversidade genética entre as linhagens. A análise de agrupamento usando o método UPGMA baseada nas distâncias genéticas dos quatro marcadores moleculares confirmou a diversidade genética reconhecida no gênero Metarhizium. As enzimas de restrição, HaeIII e MspI, evidenciaram a diversidade genética entre as linhagens ao digerirem os produtos de amplificação do locus ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA com os iniciadores ITS4 e ITS5, a enzima DraI não apresentou sítios de restrição. Os introns do grupo mRNA nuclear discriminaram as linhagens de Metarhizium apenas com a utilização do iniciador EI1. As técnicas de RAPD e regiões de Microssatélite foram eficientes em demonstrar a diversidade entre as linhagens. Porém o microssatélite (GACA)4 foi mais sensível em detectar a variabilidade intra e interespecífica entre as diferentes linhagens de Metarhizium. Não houve correlação entre grupos e regiões geográficas. As linhagens 4415, 4400 e 4897 causaram maior percentual de mortalidade das larvas de Diatraea saccharalis. Também não houve correlação entre os agrupamentos gerados pelas técnicas moleculares e percentual de mortalidade de larvas de D. saccharalis