Orientador: Renata de Oliveira Mattos GranerTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Streptococcus sanguinis é colonizador comensal da superfícies dos dentes e patógeno comum de endocardite bacteriana em seres humanos. A colonização da cavidade oral por S. sanguinis depende, em parte, de interações de superfície bacteriana com componentes adsorvidos na superfície dos dentes (que são principalmente de origem salivar) chamado película adquirida (PA). Além disso, os produtos do metabolismo aeróbio de S. sanguinis, por exemplo, peróxido de hidrogênio, inibe o crescimento de espécies de estreptococos concorrentes e promove a liberação de DNA genômico, um componente da matriz extracelular do biofilme dental. S. sanguinis se adapta fisiologicamente a saliva durante suas fases de colonização na cavidade oral, que provavelmente envolve alterações dinâmicas em seu transcriptoma. Transcriptomas bacterianos são regulados pelos sistemas de dois componentes (SDC), que consistem de uma membrana sensora de histidina quinase (HK) e um regulador de resposta intracelular cognato (RR). A HK sofre autofosforilação sob estímulos específicos e fosforila RR cognato, que por sua vez se liga às regiões reguladoras de genes alvo, induzindo ou reprimindo a transcrição. S. sanguinis SK36 tem um ortólogo de SDC SptRS designado (de Saliva persistência) envolvidos na sobrevivência e persistência na saliva humana em S. pyogenes. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do SDC SptRS na biologia de S. sanguinis. Para isso, mutantes knockout de sptR (SKsptR-) e sptS (SKsptS-) foram obtidos a partir da cepa SK36. Mutantes sptRS foram analisados quanto ao crescimento planctônico e biofilme em meio suplementado ou não com saliva humana. Liberação de DNA, produção de peróxido de hidrogênio, autólise e sensibilidade ao stresse oxidativo também foram analisados nestas cepas. Alterações da transcrição dos genes associados a fenótipos observados foram avaliadas por meio de RT - qPCR. Sob aerobiose, mutantes sptRS formaram cadeias muito longas e agregados de cocos. O crescimento mais lento em comparação com SK36 também foi observado. Por outro lado, um aumento significativo (cerca de 2 vezes ) em biomassa do biofilme foram encontrados em mutantes em comparação com SK36 na presença de saliva. Consistentemente, mutantes liberaram 2 a 5 vezes mais DNA ao meio e produziram 2 a 3 vezes mais de H2O2 em comparação com a cepa selvagem. Não foram observadas alterações em autólise induzida por alta temperatura. Os mutantes mostraram um aumento da tolerância ao stresse oxidativo, mas reduções de 1 a 2 logs na contagem de células (ufc / ml ) durante a incubação em saliva. A análise de RT- qPCR revelou que SptRS regula negativamente os genes que codificam as hidrolases mureína (SSA_0094 e cwdP); aumentos de 2,14 e 14,7 vezes nestes genes foram respectivamente observados em mutantes SKsptR-. Além disso, nos mutantes sptRS foram observados aumentos de 15,5 a 27,9 vezes em transcritos do gene spxB, que codifica a oxidase piruvato necessária para a produção de H2O2. Outros genes associados com a produção H2O2 também foram afetados nos mutantes [ackA (aumento de 5,3-9,7 vezes); tpK (aumento de 12,19 vezes)]. Este estudo fornece evidências de que SptRS regula as funções de S. sanguinis de estabelecimento em biofilmes associados à produção de H2O2 e liberação de DNA, e participa da sobrevivência das bactérias na saliva humanaAbstract: Streptococcus sanguinis is commensal colonizer of tooth surfaces and common pathogen of bacterial endocarditis in humans. The colonization of the oral cavity by S. sanguinis depends in part, on bacterial surface interactions with components adsorbed to tooth surfaces (which are primarily of salivary origin) called acquired pellicle (AP). In addition, products of S. sanguinis aerobic metabolism, e.g. hydrogen peroxide, inhibits the growth of competitor streptococcal species and promotes the release of genomic DNA, a component of the extracellular matrix of dental biofilms. S. sanguinis physiological adaptation to saliva during the stages of colonization of the oral cavity, likely involves dynamic changes in its transcriptome. Bacterial transcriptomes are regulated by two-component systems (TCS), which consist of a membrane sensor histidine kinase (HK) and a cognate intracellular response regulator (RR). The HK undergoes autophosphorylation under specific stimuli and phosphorylates the cognate RR, which in turn binds to regulatory regions of target genes, inducing or repressing transcription. S. sanguinis SK36 strain has an orthologue of the TCS designated SptRS (of Saliva persistence) involved in survival and persistence in human saliva in S. pyogenes. The aim of this study was to investigate the role of SptRS TCS in S. sanguinis biology. To that purpose, knockout mutants of sptR (SKsptR-), and sptS (SKsptS-) genes were obtained in strain SK36. SptRS mutants were analyzed regarding to planktonic and biofilm growth in medium supplemented or not with human saliva. DNA release, production of hydrogen peroxide, autolysis and sensitivity to oxidative stress were also analyzed in these strains. Transcriptional changes in genes associated with observed phenotypes were then assessed by RT-qPCR. Under aerobiosis, sptS/R mutants formed extremely long chains and aggregates of cocci. Slower growth compared to SK36 was also observed. On the other hand, significant increases (about 2-fold) in biofilm biomass were found in mutants compared to SK36 in the presence of saliva. Consistently, mutants released 2 to 5-fold more DNA to medium and produced 2 to 3-fold more H2O2 compared to parent strain. No changes were observed in autolysis induced by high temperature. Mutants showed increased tolerance to oxidative stress, but reductions of 1 to 2 logs in cell counts (cfu/ml) during incubation in saliva. RT- qPCR analysis revealed that SptRS negatively regulates genes encoding murein hydrolases (SSA_0094 and cwdP); increases of 2.14 and 14.7-folds in these genes were respectively observed in SKsptR mutants. In addition, 15.5 to 27.9-fold increases in sptR/S mutants were observed in spxB transcripts, which encode pyruvate oxidase required for H2O2 production. Other genes associated with H2O2 production were also affected in mutants [ackA (5.3 to 9.7-fold increases; tpK (12.19-fold increase)]. This study provides evidence that SptRS regulates functions for S. sanguinis establishment in biofilms associated with H2O2 production and DNA release, and participates in bacterial survival in human salivaDoutoradoMicrobiologia e ImunologiaDoutora em Biologia Buco-Dental