Orientador: Valeria Maia MerzelTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O hidrogênio é apontado como o candidato mais promissor para substituição do combustível fóssil devido a sua maior eficiência na conversão de energia útil e ausência de emissão de substâncias tóxicas. A produção de hidrogênio a partir de resíduos orgânicos é realizada por meio de digestão anaeróbica, tornando-se uma alternativa ecologicamente correta para atender à futura demanda por hidrogênio. No entanto, os micro-organismos e os processos metabólicos envolvidos estão longe de serem exaustivamente caracterizados. Nesse trabalho, amostras de uma planta de tratamento de esgoto doméstico foram analisadas em dois estudos complementares visando à caracterização de sua diversidade filogenética e a descrição de novas hidrogenases. O primeiro trabalho combinou a análise dos genes de RNAr 16S e FeFehidrogenase (hydA) com ferramentas estatísticas para estimar a riqueza e diversidade da comunidade procariótica em nível filogenético e funcional. As análises filogenéticas e de diversidade das bibliotecas gênicas demonstraram que todas as sequências de arquéias foram afiliadas a Euryarchaeota não cultivadas e, com relação ao Dominio Bactéria, Proteobacteria foi grupo filogenético predominante apresentando os maiores índices de diversidade e riqueza. As sequências putativas de hydA foram identificadas como sequências de genes de FeFehidrogenases ainda não descritas. Na segunda abordagem, a biblioteca metagenômica de fosmideo construída nesse estudo foi analisada empregando a tecnologia de pirosequenciamento 454 e resultou em aproximadamente 218 Mb de dados. Os três diferentes classificadores aplicados permitiram uma visão geral dos grupos taxonômicos mais abundantes devido ao enorme número de sequências metagenômicas não classificadas. Contudo, análises taxonômicas revelaram Gammaproteobacteria e Deltaproteobacteria, respectivamente, como as classes taxonômicas predominantes, enquanto que as espécies do gênero Methanospirillum foram dominantes entre as arquéias metanogênicas. A análise do metabolismo da comunidade microbiana através das bases de dados COG e Carma revelou que a degradação da biomassa depende de diferentes grupos filogenéticos, como por exemplo, Bacteroidia e Gammaproteobacteria, os quais foram indicados como envolvidos na degradação de carboidratos e proteínas, respectivamente. Além disso, as análises sugerem Clostridia e Methanomicrobiales e Methanosarcinales como principais micro-organismos produtores de hidrogênio e metano, respectivamente. As análises das seis sequências codificantes de FeFehidrogenase identificadas no conjunto de dados metagenômicos revelaram que essas representam novas sequências do gene alvo. Contudo, quatro dessas sequências foram identificadas na biblioteca de fosmídeo pela triagem gênica baseada no uso de PCR. O conjunto de resultados obtido nesse estudo permitiu elucidar a composição e o potencial metabólico dos micro-organismos residentes na planta de tratamento de esgoto analisada e sugere esse ambiente como um reservatório potencial de novos genes de hidrogenases para a exploração biotecnológicaAbstract: Hydrogen appears to be the most promising candidate for the replacement of fossil fuel due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power and no toxic emission production. The production of hydrogen from organic wastes is performed through the anaerobic digestion, making it an environmentally friendly alternative for satisfying future hydrogen demands. Nonetheless, the microorganisms and metabolic processes involved are far from being exhaustively characterized. In this work, samples of a domestic sewage treatment plant were analyzed in two complementary studies aiming at the characterization of its phylogenetic diversity and the description of new hydrogenases. The first one, combined the analysis of 16S rRNA and [FeFe]-hydrogenase (hydA) genes with statistical tools to estimate richness and diversity of the prokaryotic community at the phylogenetic and functional levels. Phylogenetic analysis showed that all archaeal sequences were affiliated with yet uncultured Euryarchaeota and that Proteobacteria were the most predominant and diversified phylogenetic group within the bacterial library. The putative hydA sequences were identified as hitherto undetected [Fe-Fe]- hydrogenase gene sequences. Diversity statistical analysis confirmed a great richness and diversity of bacterial and hydA sequences retrieved from the sewage sludge sample. In the second approach, a fosmid metagenomic library was constructed and analyzed employing 454- pyrosequencing technology, resulting in approximately 218 Mb of data. Three different classifiers applied allowed a broad overview of the most abundant taxonomic groups due to a huge number of metagenome reads remained unidentified. However, taxonomic analysis revealed Gammaproteobacteria and Deltaproteobacteria, respectively, as the most abundant classes, whereas species of the genus Methanospirillum were dominant among methanogenic Archaea. The analyzes of the microbial community metabolism by means of COG and Carma databases revealed that the degradation of biomass depends on different phylogenetic groups, for instance, Bacteroidia and Gammaproteobacteria were indicated as involved into the degradation of carbohydrate and proteins. Furthermore, the analysis suggested Clostridia and Methanomicrobiales and Methanosarcinales as the main microorganisms producing hydrogen and methane, respectively. Analysis of the six coding sequences of FeFe-hydrogenases identified into the dataset revealed that they represented novel target gene sequences. However, only four of these coding sequences could be detected into the fosmid library by PCR screening. The combined results obtained in this study allowed us to have an insight of the composition and potential metabolism of the microbes residing in the analyzed domestic sewage treatment plant and suggested such environment as a potential reservoir for new hydrogenase genes to biotechnological explorationDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutora em Genética e Biologia Molecular