Orientador: Marcela Rocha de Oliveira CarrilhoTese (doutorado) - Univerisdade Estadual de Campoinas, Faculdade de OdontologiaResumo: Há pouco mais de 15 anos, as metaloproteinases da matriz (MMPs) foram consideradas enzimas responsáveis pela degradação da matriz orgânica dentinária na progressão da cárie. Neste meio tempo, porém, poucos estudos foram publicados tendo como base esta premissa. Recentemente, foi indicado que outras proteases como as cisteíno-catepsinas (CTs) poderiam atuar nesta degradação. Os objetivos deste estudo foram de avaliar e comparar a abundância e atividade proteolítica de diferentes MMPs (MMP-2, -8 e -9) e CTs (B, K e L) na matriz orgânica dentinária sadia e cariada. A abundância e distribuição destas enzimas in situ, isto é, na dentina sadia e cariada, foi realizada por imuno-histoquímica convencional. A abundância de MMP-2, -9 e CTs B e K, assim como a avaliação da estrutura do colágeno nos tecidos sadio e cariado, também foram realizadas por imunofluorescência. Também foi realizada a extração dessas enzimas da dentina por diferenes métodos: 1) extração com hidrocloreto de guanidina associado ao EDTA (G-EDTA); 2) ácido fosfórico (AF); 3) ácido acético (AC) e 4) hidrocloreto de guanidina associado ao ácido acético (G-AC). A avaliação da abundância de MMP-2, -8 e -9 e das CTs B e K foi realizada por western blot. A atividade enzimática nos extratos obtidos pelos protocolos de extração foi analisada por zimografia e por espectrofluorimetria. Além disso, o grau de solubilização da matriz orgânica dentinária em tecido sadio e cariado foi avaliado pela quantificação de hidroxiprolina (HYP). As imagens de imuno-histoquímica convencional mostraram abundância de MMP-2, -8 e -9 assim como das CTs B, K e L especialmente em dentina profunda e na região da pré-dentina, com maior abundância no tecido cariado. Os mesmos achados foram observados para a imunofluorescência, sendo que no tecido cariado, além da maior abundância das proteases, a estrutura do colágeno mostrou-se alterada. A partir da extração de proteases da dentina sadia e cariada, o ensaio de western blot revelou a presença de MMP-2, -8 e -9 e CTs B e K nos diferentes protocolos, com maior abundância no tecido cariado. A zimografia mostrou atividade gelatinolítica correspondente a MMP-2 para todos os protocolos de extração, com variação em função do extrato avaliado. A espectrofluorimetria mostrou variação na atividade proteolítica de MMPs e CTs em dentina sadia conforme o extrato e protocolo de extração avaliados. O grau de solubilização da matriz orgânica dentinária foi maior no tecido cariado. A liberação de HYP também variou em função dos métodos de extração testados, com maior liberação observada para o protocolo de extração AC. Pode-se concluir que, além das MMP-2, -8 e -9, as CTs B, K e L estão presentes na dentina humana sadia e cariada, com maior abundância no tecido cariado, sendo que a presença e atividade dessas enzimas pode variar em função do método de extração de proteínas utilizado. Os resultados desse estudo sugerem que MMPs e CTs podem atuar em conjunto na degradação do matriz orgânica dentinária no processo de cárie e ainda reforçam a teoria para a fisiopatologia da cárie, em que um mecanismo proteolítico endógeno seria o responsável pela destruição da estrutura dentalAbstract: There are just over 15 years since the matrix metaloproteases (MMPs) were considered responsible for the degradation of dentin organic matrix in caries progression. From then on, only few studies were published based on this premise. More recently, it was showed that other proteases, like the cysteine-cathepsins (CTs), could also participate of such degradation process. The objective of this study was to evaluate and compare the abundance and proteolytic activity of different MMPs (MMP-2, -8 and -9) and CTs (B, K e L) in sound and carious dentin. Firstly, the abundance and localization of enzymes in sound and carious dentin was performed by conventional immunohistochemistry. In addition, MMP-2, -9 and CTs B and K abundance associated with evaluation of collagen structure in sound and carious dentin was done by immunofluorescence. Different dentin enzyme-extraction methods were also tested: 1) using guanidine-hydrochloride associated with EDTA (G-EDTA); 2) phosphoric acid (AF); 3) acetic acid and 4) guanidine-hydrochloride associated with acetic acid (G-AC). The presence of MMP-2, -8 e -9 and CTs B and K was evaluated by western blot. Proteolytic activity in dentin extracts was analyzed by zymography and spectrofluorometrically. The organic matrix solubilization in sound and carious dentin was evaluated by hydroxyproline assay (HYP). Immunohistochemistry showed the presence of MMP-2, -8 and -9 and CTs B, K and L, especially in deep dentin and predentin, showing more abundance in caries. The same results were observed in immunofluorescence, which also showed that the collagen structure was modified in carious dentin. The presence of MMP-2, -8 and -9 and CTs B and K was showed in western blot in all extraction protocols evaluated, with more abundance in carious when compared to sound dentin. Gelatinolytic activity corresponding to MMP-2 was showed in zymography, but it was different according to the extraction protocol. Proteolytic activity for MMPs and CTs was observed spectrofluorometrically in sound dentin and some variation was observed according to the extraction protocol. Dentin organic matrix solubilization was confirmed by HYP, with higher HYP released in AC extraction protocol. When comparing sound and carious dentin, organic matrix degradation was higher in caries. It can be concluded that, besides MMP-2, -8 and -9, the CTs B, K and L are also present in sound and carious dentin, with higher abundance in caries. However, the presence and activity may vary according to the extraction method used. The results indicate that both MMPs and CTs may act in concert in dentin organic matrix degradation in caries progression and also support the physiopathology theory for caries in which a host-derived proteolytic mechanism would be responsible for dentin degradationDoutoradoMateriais DentariosDoutora em Materiais Dentários