Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Marcelo Palma SirciliTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A contaminação de fórmulas infantis por Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) e Bacillus cereus pode ter como origem o contato do alimento com biofilmes formados em ambientes, utensílios e equipamentos empregados na sua produção ou posterior reconstituição nos locais de distribuição. A grande preocupação em relação a estas bactérias é a presença das mesmas em fórmulas infantis, produtos estes utilizados como fonte de alimentação para lactentes de forma exclusiva ou em combinação com outros alimentos. A formação de biofilmes, assim como outros mecanismos celulares como por exemplo a produção de bacteriocinas e fatores de virulência, podem ser modulados pelo processo de comunicação célula-célula ou quorum sensing - mecanismo de sinalização célula-célula mediada pelo acúmulo de uma classe ou mais de moléculas sinalizadoras produzidas pela célula e excretadas para o meio externo. Por sua vez, a quebra deste sistema, pela degradação das moléculas sinalizadoras de comunicação, denomina-se quorum quenching. Neste trabalho objetivou-se, primeiramente, a avaliação da dinâmica de formação de biofilmes mono e multi-espécies de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus em superfície de aço inoxidável utilizando-se como meios de cultivos fórmula Infantil (FI) e caldo Luria Bertani (LB) e a eficácia de soluções de ácido peracético e de hipoclorito de sódio na inativação desses biofilmes. Outro objetivo principal foi pesquisar a ocorrência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching em E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus e a possível influência das moléculas sinalizadoras na sensibilidade destas bactérias aos antimicrobianos. A formação de biofilmes ocorreu de forma mais intensa ao utilizar-se a fórmula infantil, quando comparado com o meio de cultivo LB, fato este relevante por ser a fórmula infantil o mais conhecido e importante veículo de transmissão de E. sakazakii (Cronobacter spp.). Tanto em cultivo mono-espécie quanto em cultivo misto, o nível de contagem de E. sakazakii (Cronobacter spp.) superou o de B. cereus e para ambos o maior desenvolvimento ocorreu em cultivos mono-espécie. Em todos os biofilmes de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus isoladamente e em cultura mista, produzidos em caldo LB e independente do tempo de formação, as contagens foram reduzidas a níveis inferiores a 1 logUFC/cm2 quando em contato com soluções de ácido peracético ([500mg/L]) e hipoclorito de sódio ([100mg/L]) por 15 minutos. No entanto, para os biofilmes produzidos em fórmula infantil ocorreram algumas situações, em que as contagens de microrganismos após o contato com as soluções de sanitizantes, foram superiores a 1 logUFC/cm2, evidenciando assim a ineficácia do procedimento de sanitização para alguns biofilmes formados a 5 dias ou mais e a necessidade da higienização das superfícies ser realizada o mais próximo do término do processamento ou reconstituição destes alimentos. Evidenciou-se a existência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching, através dos testes de atividades biológicas das culturas, extratos e suas frações. Os testes com os biossensores revelaram-se positivos para a produção de homoserinas lactonas em cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e negativos para a espécie B. cereus. Em cultivo misto de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus observou-se a redução e/ou a não detecção das homoserinas lactonas fato este possivelmente associado ao fenômeno quorum quenching. A possível presença de moléculas sinalizadoras AI- 2 e AI-3 foi evidenciada, sendo confirmada a presença de moléculas sinalizadoras AI-1. A caracterização do AI-1 realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) revelou a capacidade da cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) em produzir três compostos, N-heptanoil-HSL, N-dodecanoil- HSL e N-tetradecanoil-HSL, substâncias estas ainda não reportadas na literatura para o microrganismo em estudo. Os autoindutores sintéticos C7-HSL, C12-HSL e C14-HSL adicionados a cultura de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus não exerceram efeito sobre a sensibilidade aos antimicrobianos, sugerindo que estas moléculas não estariam envolvidas em mecanismos de resistência a estes antimicrobianos. Em resumo este trabalho representa um importante passo no estudo da formação de biofilmes e dos sistemas quorum sensing e quenching para as bactérias em questão, cujos conhecimentos são de grande interesse na segurança dos alimentosAbstract: The contamination of infant formulas by Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus can occur due to contact with biofilms formed in the environment and on equipment used in their production and reconstitution. There is concern about these bacteria due to their presence in foods used as a source of nutrition for infants. Biofilm formation as a wide spectrum of important processes is reported to be regulated by quorum sensing, including, for example, antibiotic production and virulence. Cell-to-cell communication or bacterial quorum sensing is a signaling mechanism that refers to the ability of bacteria to respond to chemical molecules called autoinducers, in response to cell density. Degradation of the signaling molecule prevents it from accumulating in sufficient amounts, leading to disruption of the communication system, known as quorum quenching. The aim of this study was first to evaluate the formation of mono and multi-species biofilms of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus on stainless steel surfaces using infant formula (FI) and Luria Bertani (LB) broth as the culture media, and the efficacy of sodium hypochlorite and peracetic acid in inactivating these biofilms. The other objective was to investigate the involvement of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus in quorum sensing and quorum quenching systems and the possible influence of the signaling molecules on the sensibility of these bacteria to antimicrobials. The formation of biofilms was greater when using the infant formula than the Luria Bertani broth, this fact being important since the infant formula is considered to be an important vehicle in the transmission of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) to infants. In both cases, the growth of the mono species was greater than in the multi species culture. In all the biofilms formed in the Luria Bertani broth, independent of the time of formation, the counts were reduced to less than 1 log CFU/cm2 when in contact with sodium hypochlorite ([100mg/L]) or peracetic acid ([500mg/L]). However for the biofilms produced in the infant formula, many situations occurred, with counts more than1 log CFU/cm2 in some situations after the contact with sanitizers highlighting the need for na efficient sanitization of the surfaces as soon as the processing or reconstitution of these foods has finished. The experiments with biosensors provided evidence of the occurrence of quorum sensing and quorum quenching systems using bioassays with the cultures and extracts of the microorganisms under examination. These bioassays were positive for the production of homoserine lactone by E. sakazakii (Cronobacter spp.) but negative for B.cereus. In the mixed culture a reduction and/or non-detection of the homoserine lactone was observed, a fact that could be associated with quorum quenching. A possible presence of the signaling molecules AI-2 and AI-3 was evident and the presence of AI-1 was confirmed. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses allowed for a chemical identification of the production of N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl- HSL and N-tetradecanoyl-HSLby the E. sakazakii (Cronobacter spp.), a fact not previously reported in the literature. The addition of synthetic signaling molecules (N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl-HSL and N-tetradecanoyl-HSL) had no significant effect on the sensibility of the E. sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus strains to antimicrobials. In summary this study represents an important step in biofilm's formation, quorum sensing and quorum quenching in these bacteria that are of great interest in food safetyDoutoradoDoutor em Tecnologia de Alimentos