Seleção e desenvolvimento de adjuvantes para uso em imunizações com proteínas recombinantes de Plasmodium

Abstract

The C-terminal region of Plasmodium merozoite surface protein 1 (MSP119) is being studied as one of the main targets for the development of a vaccine against malaria. Several studies have shown high imunogenicity of this region in experimental immunizations when injected in the presence of strong adjuvant formulations. In the present study we evaluate the possibility of using recombinant proteins based on the sequence of MSP119 to immunize mice by a mucosal route. Also, we generate new recombinant proteins consisting in the genetic fusion of the MSP119 to the flagellin FliC (flagellar protein of Salmonella enterica Typhimurium), to increase the immunogenicity of the antigen. Initially, we evaluated the capacity of the molecules cholera toxin (CT), heat-labile E. coli enterotixin (LT) or CpG ODN 1826, to act as adjuvants in mucosal intranasal immunization of mice with the recombinant proteins His6PvMSP119 or His6PvMSP119-PADRE (containing the universal T helper epitope PADRE). When administered in the presence of CT or LT, both recombinant proteins were highly immunogenic by the intranasal route. CpG ODN 1826 was less efficient as adjuvant by this route. The addition of CpG ODN 1826 in CT adjuvanted immunizations increased the specific IgG2c titers. These results showed that CT and LT are potent mucosal adjuvants in immunizations with recombinant malaria antigens and that CpG ODN 1826 can, in this case, be used as a tool to modulate the pattern of the immune response. Subsequently, we expressed a recombinant protein consisting of the sequence of PvMSP119-PADRE genetically fused to FliC (His6FliC-PvMSP119- PADRE). We showed that this fusion protein preserved the antigenic properties of PvMSP119 and the ability of flagellin to activate TLR5. The immunization of mice using this recombinant fusion protein induced high titers of specific antibodies and the presence of antigen-specific IFN-g producing cells in the spleen. The addition of CpG ODN 1826 in the vaccine formulations modulated the immune response by augmenting the specific titers of IgG2c. In addition, sera from immunized mice recognized the parasite in indirect immunofluorescence assay (IFA). Our results provided a new class of malaria vaccine formulation with intrinsic adjuvant property capable of stimulating specific humoral and cellular immune responses when administered alone or in the presence of other adjuvants. Finally, we expressed a recombinant protein containing the sequence of Plamodium falciparum MSP119 (PfMSP119) fused to FliC (His6FliC-PfMSP119). This fusion protein retained the capacity of flagellin to activate TLR5. Immunization of mice with the His6FliC-PfMSP119 alone induced high titers of specific antibodies and IFN-g producing cells. The addition of adjuvants such as CpG ODN 1826 or Quil-A (saponin of Quillaja saponaria) increased the levels of IgG2c and the cellular immune response, measured by the IFN-g secretion by immune spleen cells in culture. In addition, sera from immunized rabbits recognized the parasites in IFA and inhibited parasite growth in vitro. These results provide evidences that the fusion of malaria antigens to flagellin is an inexpensive and viable alternative for the development of a malaria vaccine.

A região C-terminal da proteína 1 de superfície de merozoítas de Plasmodium (MSP119) vem sendo estudada como um dos principais alvos para desenvolvimento de uma vacina contra malária. Estudos têm demonstrado a imunogenicidade desta região em vacinações experimentais utilizando proteínas recombinantes na presença de adjuvantes fortes. No presente estudo, consideramos a possibilidade da utilização de proteínas recombinantes baseadas na sequência da MSP119 para imunização de camundongos por uma via de mucosa. Também geramos novas proteínas recombinantes de fusão da MSP119 com a flagelina (proteína do flagelo de Salmonella enterica Typhimurium), com o intuito de aumentar a imunogenicidade deste antígeno. Avaliamos inicialmente a capacidade de atuação das moléculas toxina colérica (CT), toxina termo-lábil de E. coli (LT) e do oligodeoxinucleotídeo CpG ODN 1826 como adjuvantes em imunizações de camundongos pela via de mucosa intranasal, utilizando como antígenos as proteínas recombinantes baseadas na MSP119 de P. vivax His6PvMSP119 ou His6PvMSP119-PADRE (contendo o epítopo “helper” universal PADRE). Quando administradas na presença dos adjuvantes CT ou LT, ambas foram altamente imunogênicas pela via intranasal, induzindo altos títulos de anticorpos, maiores do que quando utilizamos o CpG ODN 1826 como adjuvante. A adição do CpG ODN 1826 em imunizações na presença de CT foi capaz de aumentar a resposta específica de IgG2c. Nossos resultados demonstraram que CT e LT são adjuvantes potentes de mucosa em imunizações com antígenos recombinantes de malária, e que o CpG ODN 1826 pode ser utilizado como ferramenta de modulação da resposta imune nestas imunizações. Subsequentemente, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da PvMSP119-PADRE fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PvMSP119-PADRE). Demonstramos que essa proteína de fusão retém as propriedades antigênicas da PvMSP119 e a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos utilizando somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células específicas produtoras de IFN-g medidas no baço dos animais imunes. A adição de CpG ODN 1826 nas imunizações foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c. Além disso, os soros dos camundongos imunizados foram capazes de reconhecer os parasitas por imunofluorescência indireta (IFA). Estes resultados demonstraram uma nova classe de antígenos candidatos à vacina contra malária, com atividade adjuvante intrínseca e capaz de estimular respostas imunológicas humoral e celular específicas, quando administrada sozinha ou na presença de outros adjuvantes. Por fim, expressamos em bactérias E. coli uma proteína recombinante contendo a sequência da MSP119 de P. falciparum (PfMSP119) fusionada à flagelina FliC de S. enterica Typhimurium (His6FliC-PfMSP119). Demonstramos que esta proteína de fusão retém a capacidade da flagelina de ativar o receptor TLR5 da imunidade inata. A imunização de camundongos com somente esta proteína recombinante de fusão induziu altos títulos de anticorpos, além de células produtoras de IFN-g específicas contra a PfMSP119. A adição de adjuvantes como CpG ODN 1826 ou Quil-A (saponina de Quillaja saponaria) nas imunizações com a proteína recombinante de fusão foi capaz de imunomodular a resposta de anticorpos, aumentando os títulos de IgG2c, bem como de potencializar a resposta celular medida pela produção de IFN-g contra a PfMSP119. Os soros de coelhos imunizados com a His6FliC-PfMSP119 sem a adição de nenhum adjuvante apresentaram altos títulos de anticorpos específicos contra a PfMSP119, que foram capazes de inibir o crescimento do parasita in vitro. Esses resultados sugerem a estratégia de fusão de antígenos de plasmódios como uma alternativa viável de desenvolvimento de uma vacina barata e eficaz contra a malária.