Dissertation
Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensis
Fecha
2011Registro en:
Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensis. 2011. 93f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2011
Autor
Santos, Elisangela Madureira dos
Institución
Resumen
As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas
atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de
novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de
fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser
modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e
vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção,
ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está
presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de
KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens
sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há
associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos
parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da
infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas,
juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga
parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de
diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos
(modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não
paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada
a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos
em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há
um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de
passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões
maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto
ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com
promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos
camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na
infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número
das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de
macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos
infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da
lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos
promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a
porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11
na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na
expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma
associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L.
amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há
diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína
KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a
diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na
infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como
um fator de virulência.